【毕业学位论文】（Word原稿）抗原基因密码子及其表达载体的优化增强H5亚型禽流感DNA疫苗的免疫保护效果预防兽医学论文定稿

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 抗原基因密码子及其表达载体的优化增强 苗的免疫保护效果 5 A D. 5 A 中国农业科学院博士学位论文 摘要 - I - 摘 要 禽 高致病力禽流感（ 被国际兽医局列为 年来发现， 7亚型高致病力禽流感病毒 (但可给养禽业造成巨大损失，而且可以感染人并致人死亡， 有重要的公共卫生学意义，对 苗 是 防 制 禽 流 感 最 具 潜 力 的 基 因 工 程 疫 苗 之 一 。 以 (（ 野生型 含 强子的 5亚型 别以 100g、 500行免疫后 攻毒保护试验及保护性抗体持续期研究。试验结果表明， 00g、50 D/1/96（ 击形成 100的完全免疫保护（不发病、不排毒），免疫后诱导的有效保护性 10传统的全病毒灭活疫苗相比， 5亚型高致病力禽流感具有免疫保护期长、不干扰常规血清学免疫监测的突出优点，但也存在免疫剂量大、使用成本高的缺陷。 免疫原基因的密码子及其真核表达载体的优化是提 高 码氨基酸密码子的摇摆性导致了不同物种间细胞在蛋白翻译过程中具有密码子使用的偏嗜性。鸡与哺乳动物细胞在蛋白翻译过程中具有相同的密码子偏嗜性，但与 此，利用寡核苷酸合成及重叠延伸 D/1/96( 作为 以及野生型 别插入 子表达载体 建的93 5亚型 种表达质粒均可获得正确表达；间接免疫荧光检测转染后 24 48小时 293码子优化的 一结果为进一步开展 选优化的 为评估 5亚型禽流 感 000周龄 4周后分别用 100( 5/01(鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第 3、 5、 7采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清 四种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估 。结果， 100可对免疫鸡形成 100 完全保护（不发病、不致死、不排毒）， 种 国农业科学院博士学位论文 摘要 - 10对免疫鸡形成 100完全保护（不发病、不致死、不排毒）， 种 0 为进一步评估二次免疫条件下 因密码子优化及不同表达载体对 型 苗免疫效果的影响，质粒 别以 100g 和 10g 肌肉注射免疫3 周龄 ，免疫后第 4 周以同样剂量和途径加强免疫，加强免疫 2 周以 100 N/45/01(腔感染攻毒，对三种疫苗加强免疫后的免疫保护效果进行比较 评估 。 结果，100g 剂量加强免疫组中， 可对免疫鸡形成 100 完全保护（不发病、不致死、不排毒）；三种 苗加强免疫所诱导的平均 体水平由高到低依次为 10g 剂量加强免疫组中， 00 完全保护（不发病、不致死、不排毒）， 形成对免疫鸡的部分免疫保护；比较三种 苗 10g 加强免疫所诱导的平均 体反应水平 ， 近，而显著高于 本研究首次证实 苗在鸡体内可诱导长期持续的高水平保护性 体，并首次证明 动子表达载体 著提高 型禽流感 苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果，同时证明，通过密码子和载体的优化，可使 型禽流感 苗有效免疫保护剂量降低至 10g 水平，其推广应用已具备充分的经济可行性。 为免疫效果良好、成本低廉的优化 苗，有望成为 预防 型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。 关键词： 型禽流感， 苗，密码子优化中国农业科学院博士学位论文 英文摘要 - i - as H5 7 in is of 5 by A (MV PF 00g, 50g 0g in a 3 by I 00g 0g I no no I 0g 00g of of of of NA be by or of It is in in in CR we a 5 A by of of A s as A as 93T by A by A A in in in To PF 00g 0g of 00l A of 00l as I 00of (5/01(, 中国农业科学院博士学位论文 英文摘要 - , 5 of in in 00g I I to in no no no in of 0g of I I to in no no no in To NA or PF 00g 0g of in a 4 A of 00l as of I 00of N/45/01( , 5 of in in 00g I I to In 0I of in no no no in in 2 In 5 A NA I in NA be a a 5HA in 5N1 at 0g, of NA in H5 目录 - i - 目 录 引言 . 1 1 禽流感流行历史及现状 . 1 . 1 . 2 国 行历史 . 4 2 公共卫生意义 . 5 人流感相关的禽流感事件 . 5 生导致人流感大流行病 毒株的可能机制 . 6 3 禽流感的疫苗防制 . 7 流感疫苗的研究与应用历史 . 7 种主要的禽流感疫苗 . 8 4 苗研究进展 . 11 动物病原相关的 苗 . 12 苗的免疫机理 . 13 苗的优化 . 17 小结 . 20 实验一 表达 型 因的 苗对 击的免疫保护效果及保护性抗体持续期研究 . 22 1 材料与方法 . 23 毒 . 23 胚和 . 23 苗质粒 . 23 I 阳性抗原 . 23 苗质粒的大量制备及其纯化 . 23 疫 . 24 毒 . 24 体测定 . 24 毒分离 . 25 体持续期测定 . 25 2 结果 . 26 同剂量 疫对 型 击的免疫保护结果 . 26 2.3 疫后诱导产生的 体至少可以持续一年 . 28 3 讨论 . 29 实验二 密码子优化的 型 因构建及其 苗表达载体优化与体外表达研究 . 31 1 材料与方法 . 32 种及质粒 . 32 及相关试剂 . 33 养液 . 33 5 亚型阳性血清 . 33 抗 . 33 中国农业科学院博士学位论文 目录 - 5 亚型 因鸡体偏嗜性密码子的改写与序列分析 . 34 于 寡核苷酸片段和引物的合成 . 36 1.8 因 11 个小片段的 增 . 36 1.9 因 11 个小片段的克隆 . 37 因 构建策略 . 38 因 定及酶切分析 . 39 因 测序验证 . 39 达质粒 构建 . 39 粒 293T 细胞中的表达 40 2 结果 . 42 因 段酶切位点 . 42 2.2 因小片段的 增 . 42 2.3 因小片段的克隆与测序 . 43 因 定及酶切分析 . 43 因 测序验证 . 44 粒 构建 . 47 粒转染 293T 细胞的间接免疫荧光结果 . 49 A 蛋白在 293T 细胞中的表达产物检 测 . 49 3 讨论 . 53 实验三 抗原基因密码子及其表达载体的优化增强 型禽流感 苗免疫保护效果 . 55 1 材料与方法 . 56 毒 . 56 胚和 . 57 苗质粒 . 57 I 阳性抗原 . 57 苗质粒的大量制备及其纯化 . 57 的免疫 . 57 毒 . 58 体检测 . 58 毒分离与滴定 . 58 2 结果 . 58 次免疫试验 . 58 强免疫试验 . 69 3 讨论 . 79 结论 . 82 参考文献 . 83 致谢 . 98 . 100 中国农业科学院博士学位论文 引言 - 1 - 引 言 禽流感（ 由正粘病毒科、流感病毒属、 或疾病综合征。 100多年前人类首次在意大利证实该病的存在，目前已经在全世界广泛流行。 所有的禽类均对禽流感病毒易感，但不同类种的禽对该病的抵抗力不同。禽流感的感染在禽类有很宽的症状谱，从轻微的发病到迅速感染和快速致死，并引起严重的流行。因而，根据其致病力的不同，禽流感可以分为低致病力禽流感（ 高致病力禽流感（ 速发病，并迅速引起禽群的大批死亡，其致死率通常可以达到 100，因而被 类动物传染病。 近年来， 反， 别是 2003年底到 2004年年初在亚洲流行的 及到 10多个国家和地区，我国也不例外。这次 且在越南和泰国引起人的感染并死亡。 的严重威胁人畜健康的病毒亚型随时可能出现，由它们引起的新兴疫病（ 一种长期存在的潜在威胁。因此， 其防制将是各国政府和疫病控制及研究机构长期而艰巨的任务。 虽然用疫苗控制 疫苗结合其他控制措施的应用在控制 而，疫苗接种仍然是当前世界范围内控制 一。在对疫苗的使用保持乐观的同时，我们不能忽略当前使用的疫苗所引起的负面影响和潜在威胁。为克服这些缺点，新型的 中 可能成为未来控制 1 禽流感流行历史及现状 人类对禽流感的认识始于十九世纪七十年代， 1878年 后，禽流感在世界范围内广泛传播，许多国家和地区均有禽流感暴发流行的历史，禽流感疫情给养禽业造成了重大的经济 损失。 于众多的 至目前为止，除 5亚型的一些毒株外，大部分 且迄今为止，除鸭、鹅外（ et 1987），还没有从外表健康的水禽中分离到至对一种鸟表现为高致病性的 其它禽种来说却有可能是低致病性的（ et 1986），一般来讲，对于鸡是高致病力的病毒往往对鸭表现为低致病性。由 I，死亡率远没有 而其存在却相当广泛，仅 1998年，就从美国活禽市场 的鸡中中国农业科学院博士学位论文 引言 - 2 - 分离到 415株 中 372株 33株 1株 1株 1株 1株 株 仅仅引起轻微的发病。如 981)报道的 2的火鸡产白壳蛋。其他同期的火鸡中暴发的 0 40和呼吸道疾病，但引起的死亡率不高。 在一些特殊的 毒也引起了严重的疾病和死亡。如 1975年美国阿拉巴 马州暴发的由 有记录的鸡群中引起的死亡率为 69（ et 1977）。 1995年美国犹他州暴发的由 中 0至 4周龄火鸡的致死率为 40（ et 1998）。在多数情况下，这种高的致死率都是与其他细菌病混合感染有关，如埃希氏大肠杆菌和巴氏杆菌感染。在 1997年意大利由 鸡被大量感染。肉用火鸡的临床和死后症状的严重程度有显著的变化，临床症状以呼吸困难为主，根据感染鸡年龄的不同，死亡率从 5到 97。在幼龄肉鸡，临床症状通常都很严重，致死率为 40 90。在种火鸡，观察到了相同的温和的临床症状，表现为肺部有水泡音、咳嗽、眼睑肿胀、高烧伴随食欲废绝。在急性期，产蛋量下降了 30 80，但是一部分患鸡从发病开始算起 3周后恢复到亚正常状态。致死率从 5 20（ et 2000）。同样，近些年在巴基斯坦和伊朗报道的由 于鸡和火鸡，特别是散养鸡和火鸡，当出现 之后，就会迅速出现大量的禽只死亡，死亡率通常会在几天内达到 100。除高致死率外，所表现的临床症状可能有：产蛋停止、呼吸道症状、肺部水泡音、大量流泪、鼻窦炎、头脸部肿大、皮下出血、皮肤苍白（特别是头和肉髯）和腹泻，有时可能会出现神经症状。当出现这些症状时，禽通常即将死亡。 自 1959年，苏格兰首次暴发由 1993； et 2002； et 2001； et 1998）。每次 表 1)。例如，美国政府为了消灭 1983年宾夕法尼亚州暴发的 资 6000万美元，扑杀了 1700万只鸡，而消费者更是支出了 巴基斯坦 1994年的 220万只鸡感染了 亡率高达 51 1995年墨西哥政府为了扑灭和净化由 及 12个州的 汰了 1800万只鸡，封锁了 3200万只鸡，紧急接种 接经济损失达 10亿美元，之后，墨 西哥政府在三年内又接种了 接损失无法估计；在轰动世界的 97年香港禽流感事件中，特区政府耗资 1亿港币，扑杀了 150万只鸡； 2001年，香港再度发现 区政府又斥资 8000万港币扑杀 120万只鸡，并且至今没有办法将 1985年澳大利亚 00万美元。值得注意的是，从 2003 2004年年初， 及欧洲荷兰、德国、丹麦；亚洲韩国、日本、中国、台湾、越南、巴基斯坦、柬埔寨 、泰国、老挝等；美洲加拿大、美国等，不但对暴发国家的养禽业和经济造成了重大损失，同时对 中国农业科学院博士学位论文 引言 - 3 - 表 1. 1959 年以来全世界 发情况 . in 959 时间 国家 /地区 感染动物种类 亚型 1959 苏格兰 鸡 963 英格兰 火鸡 966 加拿大 火鸡 976 澳大利亚 鸡 979 德国 鸡 979 英格兰 火鸡 983 1985 美国 鸡 , 火鸡 983 爱尔兰 火鸡 985 澳大利亚 鸡 991 英格兰 火鸡 992 澳大利亚 鸡 994 澳大利亚 鸡 994 1995 墨西哥 鸡 994 巴基斯坦 鸡 997 澳大利亚 鸡 997 香港 鸡 997 意大利 鸡 999 2000 意大利 火鸡 002 香港 鸡 002 智利 鸡 003 荷兰 鸡 003 比利时 鸡 003 德国 鸡 003 韩国 鸡 、喜鹊 004 越南 鸡 、猪 004 日本 鸡 、乌鸦 004 台湾 鸡 004 泰国 鸡 、鸭、火鸡、鹅、驼鸟、孔雀