【毕业学位论文】（Word原稿）犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及在诊断应用上的研究预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 犬细小病毒 因的克隆、表达及在诊断应用上的研究 P2 P2 I 摘要 犬细小病毒病（ 是由犬细小病毒 (起犬的一种急性传染病。本病在世界各地均有发生，各种年龄、品种的犬易感，尤其是断奶后幼犬的发病率和死亡率均很高。 随着养犬业的发展，对犬病的防控日趋 重要。因此，制定积极有效的预防措施，获得及时准确的诊断信息至关重要。 本试验通过设计合成特异性引物，扩增 因并进行了原核表达，纯化后获得 组蛋白，以其为包被抗原建立敏感、特异、检出率高的间接 法；同时用此方法对抗 异性单抗进行筛选，以获得了抗 异性单抗。 根据 布的 因序列 ， 设计并合成一对特异性引物 ， 以 增出 因片断，将其 克隆到 体中 。经过测 序后，将 因亚克隆至原核 表达载体 ，然后 转入表达宿主菌 ， 表达了目的蛋白， 表达量为 29%， 分子量约为 67通过 明该重组蛋白具有抗原性 。 组蛋白 经 镍离子亲和树脂 纯化，纯度达到 用 组蛋白作为包被抗原， 确定了最佳优化条件和结果判定标准。通过特异性试验证明包被的抗原仅与 准阳性血清发生反应，不与犬瘟热、犬腺病毒、犬副粘病毒、波特氏杆菌等疫病的标准阳性血清发生交叉反应；与进口 剂盒进行比对，对血清样品 92 份的检测结果表明符合率为 对相同的血清样品 48 份进行了 4 次重复试验变异系数小于 16%。因此本试验成功的 建立了检测 清抗体的间接 法。应用该方法对国内部分地区采集的血清样品 227 份进行检测，其中 164 份为阳性，阳性率为 以纯化的 免疫 c 小鼠，应用杂交瘤技术，采用已建立的间接 株，分别命名为 类鉴定结果表明 它为 链均为 k 型。果表明均与 组蛋白和 生反应，证明这些单抗具有良好的特异性。 关键词 犬细小病毒， 组蛋白，间接 克隆抗体，应用 is an of by be in of by in of of it is to In of be to P2 P2 is in P2 by of P2 by A of is to P2 is 9% of a of 7a ml is by P2 as be PV is 2 of 8 of of is 6%. is on in of we 27 64 of is to c of c 4 P2 by of P2 P2 录 前言 . 1 1 犬细小病毒病概述 . 1 原 . 1 态特点和理化性质 . 1 凝特性 . 1 养特性 . 2 基因组结构 . 2 码的蛋白及功能 . 2 病机理 . 4 细小病毒病的流行病学 . 4 起源和的进化 . 4 的抗原型 猫中的出现 . 5 原流行情况 . 6 床特征和病理变化 . 6 细小病毒诊断方法 . 6 凝和血凝抑制试验 . 7 毒分离 . 7 镜与免疫电镜 . 8 疫色谱法 . 8 联免疫吸附试验 . 8 合 酶链式反应 . 9 克隆抗体技术 . 9 2 研究目的和意义 . 10 实验报告一 因的克隆及其在大肠杆菌中 的表达 . 11 1 材料与方法 . 11 料 . 11 毒 . 11 体与菌株 . 11 化试剂及试剂盒 . 11 要仪器设备 . 12 法 . 12 毒 提取 . 12 因的克隆与鉴定 . 12 组表达质粒的构建与鉴定 . 15 组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 . 16 组蛋白的可溶性分析 . 16 达产物的纯化 . 17 达蛋白的 定 . 17 2 结果 . 17 增 . 17 组克隆载体酶切鉴定 . 17 2.3 苷酸序列测定结果 . 18 V 组表达载体酶切鉴定 . 18 组蛋白 表达与纯化 . 19 组蛋白 表达 . 19 组蛋白的纯化及 果 . 19 3 讨论 . 20 组蛋白原核表达 . 20 达载体的选择 . 20 核表达条件的优化 . 21 涵体蛋白的纯化 . 21 目的蛋白的选择及应 用 . 22 实验报告二 接 断方法的建立 . 23 1 材料与方法 . 23 料 . 23 验用血清 . 23 要的仪器设备 . 23 接 作程序 . 24 接 断方法的建立 . 24 原最适包被量与血清最适稀释度的确定试验 . 24 标抗体最适稀释倍数与最适作用时间确定试验 . 24 作条件的优化 . 25 定标准试验 . 25 法性能评价 . 26 异性试验 . 26 感性试验 . 26 内重复试验 . 26 全病毒 测试剂盒检测结果比较试验 . 26 接 断方法的应用 . 27 2 结果 . 27 接 断方法的建立 . 27 原最适包被量与血清最适稀释度的确定 . 27 标抗体最适稀释倍数与最适作用时间确定 . 28 作条件的优化 . 28 定标准 . 29 法性能评价 . 30 异性试验 . 30 感性试验 . 31 内重复试验 . 31 全病毒 测试剂盒检测结果比较试验 . 32 用建立的诊断方法检测国内部分地区样品的结果 . 32 3 讨论 . 32 接 法的条件优化 . 32 接 断方法的判定标准及应用 . 33 实验报告三 抗 克隆抗体的制备与鉴定 . 35 1 材料与方法 . 35 料 . 35 胞、毒株与实验动物 . 35 主要试剂 . 35 要仪器 . 35 法 . 36 原制备及纯化 . 36 物免疫 . 36 细胞准备 . 36 饲养细胞的准备 . 36 疫脾细胞的制备 . 37 胞融合及选择性培养 . 37 性克隆的筛选 . 37 染和控制 . 38 胞的冻存 . 38 鼠腹水的制备 . 38 克隆抗体特性鉴定 . 38 2 结果 . 40 交瘤细胞的筛选 . 40 克隆抗体的腹水效价的测定 . 40 克隆抗体亚类鉴定 . 40 原识别位点分析 . 40 定 . 41 3 讨论 . 41 性克隆筛选的要点 . 41 克隆抗体的 应用 . 42 结 论 . 43 参考文献 . 44 附 录 . 49 致 谢 . 52 作者简介 . 53 中国农业科学院硕士论文 前 言 1 前言 1 犬细小病毒病概述 犬细小病毒病（ 是由犬细小病毒 (起犬的一种急性传染病，各种年龄的犬都能感染（ V, et 。 断奶后的幼龄犬最为易感，传播速度快，发病率和死亡率高达 70 以上 （ P M,et 。随着年龄的增长， 成年犬一般只出现感染后的免疫反应，无明显的临床症状。 自 1983 年，徐汉坤等 （ 徐汉坤， 1983）正式报道犬细小病毒病在我国流行以来，该病对我国养犬业造成了极大的危害。 原 态特点和理化性质 细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属 的成员（ 方忠意， 2005） ， 具有细小病毒属的典型形态和结构。病 毒粒子为等轴对称的二十面体，无囊膜。在电镜下观察，病毒颗粒的外观呈圆形或六边形，直径约 261993） 。核酸由单股 成， 占整个病毒粒子重量的 25 34 ， 分子量为 06 06，沉淀系数为 23 S 27 S。在 度梯度离心沉淀时，大部分感染性病毒粒子存在于 g/度节，小部分感染性病毒粒子存在于 g/衣壳和含有不完整 因组的病毒粒子分别存在于 g/g/殷震，1997） 。 外界各种理化因素有较强抵抗力。 耐受 65 30不丧失感染性，低温长期存放对其感染性无明显影响，室温下可存活 90 天，在粪便中可存活数月和数年。对乙醚、醇类、氯仿、去氧胆酸盐有抵抗力，而福尔马林， 氯酸钠、氨水、氧化剂和紫外线能使其灭活。 凝特性 凝特性较强，在 4 或 25 条件下不仅能凝集猪的红细胞，而且能凝集恒河猴的红细胞，这一特性可作为病毒鉴定的 参考指标（ 殷震， 1997） 。经福尔马林灭火后，多学者研究证实， 间有共同的抗原组成，能发生血清学交叉反应，但又有各自的抗原成分。 据报道，在同样的条件 (红细胞、温度、下， 血凝 (度至少比 8 倍。 间也有某些共同的抗原组成， 两者之间能出现免疫荧光和血凝抑制交叉现象 。 能凝集马、中国农业科学院硕士论文 前 言 2 猫和仓鼠的红细胞 (徐汉坤 ， 1983； ， 1988) (， 1988)报道，应用硼酸缓冲盐溶液和病毒调节稀释剂 (凝集犬和绵羊的红细胞，但不能凝集牛、山羊、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、地鼠、鸡、鹅和人的 O 型红细胞。 养特性 细小病毒的 制发生在细胞核内，其复制过程出现于细胞周期的 S 期。这是因为细小病毒 制完全依赖于宿主 合酶及其复制体系。利用 合酶抑制剂处理宿主细胞，发现细小病毒 宿主细胞内不能进行复制，现在已经证实细小病毒 制既可利用宿主 合酶，也可使用宿主 宿主 合酶的作用下，病毒 滚发夹模式进行复制，它通过自身 端回文序列所形成的反转回折 3 端作为引物，起始 成。 在多种不同类型的细胞内增殖，近年常用 传代细胞分离培养病毒。犬细小病毒的基因组是在感染细胞的染色体复制开始以后才在细胞核内合成的，说明犬细小病毒的复制能力有缺陷 (殷震， 1997)， 当体外进行病毒培养传代时，不能象一般常规那样，等到细胞形成单层后才接种病毒，而必须在细胞培养的同 时或最迟在 24 样才能达到使病毒增殖的目的。 殖后可引起 胞脱落、崩解和破碎等明显的细胞病变，病毒虽能在 胞内良好增殖，但无明显细胞病变，有时出现细胞圆缩，并常形成核内包涵体。 基因组结构 一种自主复制的细小病毒，基因组是负股、单链、线形 因组含有 5 323个核苷酸 (2000)，是 毒中最小的。基因组含有两个开放阅读框架 ( 第一个 基因组左半部分 5 42成， 编码非结 构蛋白 第二个 于基因组的右半部分，即 45 90编码结构蛋白 个 别有自己的启动子，非结构蛋白和结构蛋白的 止于共同的 ) 末端，且可通过 可变剪接形成不同的翻译模板。 显著的特点是基因组结构末端有发夹结构，该结构对病毒复制十分有效。位于 3 端的回文序列大约 115种 段自身能够反折以形成一种发夹结构，这种结构较自身互补链间的氢键稳定； 5 端也是回文结构，并且能形成发夹 (2000)，这一结构对 复制是十分重要的，由于病毒复制能力有缺陷，其基因组需在感染细胞的染色体复制开始后在细胞核内合成。 码的蛋白及功能 因组主要编码四种蛋白， 由早期转录物翻译的非结构蛋白 期转录物翻译的结构蛋白 病毒粒子中含有 3 种多肽 3 7和 5在空衣壳蛋白中只含有 种蛋白质。 子表面由 60 个中国农业科学院硕士论文 前 言 3 结构亚单位装配而成， 90 ，而 占 10 ，因此 构成衣壳蛋白的主要成分。 存在于完整的病毒粒子衣壳蛋白中，是 基端水解掉 15 20 个氨基酸形成的，它只在衣壳装配和病毒基因组包装后出现，其相对量随着感染进程和发展而增加。 初合成的病毒蛋白是非结构蛋白，这是因为非结构蛋白的转录本要比结构蛋白的转录本出现的早，而且一个或两个非结构蛋白负责对细小病毒的基因表达行使调控作用。有一些研究表明，细小病毒基因组编码合成的 病毒基因表达具有反式激活功能（徐耀先， 2001）。 翻译合成后，均产生磷酸化，而衣壳蛋白则在 N 端形成乙酰基化，但 翻译后还可进行磷酸化，当这些衣壳蛋白在昆虫细胞中合成时，它们能够自我组装形成病毒粒子。 高分辨率的 射线分析 衣壳，由 8 组反向平行的 折叠和 4 个镶嵌于 折叠的大环组成。环 3 和环 4 通常组成长的 ，环 1、 3、 4 来自三个不同 子彼此紧密靠近、延长、相互作用于三倍体亚单位。这些亚单位高度缠绕在三倍体轴处形成一个 的突起，在这些突起上含有大部分与病毒的抗原物质相关 的残基（ 994）。四个环构成病毒衣壳表面的大部分，并且包括从 构的 547 个残基裂解下来的 364 个残基。相反， 端的 37 个残基很少见到，推测可能是由于 规则的自然结构。有结论报道，氨基端大部分离开五倍体轴而位于衣壳外表面，另一个重要的抗原位点已证明位于这些氨基端（ 1995； 1994； 1993； 1991）。 环的结构决定了病毒的许多性质，从抗原角度来看，两个重要的 中和位点由这些环决定（ A， 1991） 。位点 A 来自同一 环 1 和环 2 以及三倍体分子环 4。环 2 在形成这个抗原位点时的作用表现在 222、 224 位点变异的结果。位点 A 涉及的抗原漂移还通过环 4 上的 426 残基，使 成 2a 型和 2b 型。位点 B 位于环 3 的延长部分三倍体突起的肩部，包括 299、 300、 302 残基。实际上， 300 位点残基是最易突变的残基。单克隆抗体识别这两个决定簇影响血凝抑制（ 1994）。然而，这些改变不影响体内交叉保护。 白在病毒感染过程中起着极为重要的作用。缺失 白的突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性。对 构蛋白的分析及编码基因突变的研究发现， 壳蛋白某些区域，甚至几个残基对 染细胞有重要影响，如蛋白 93 位残基以及邻近 300 位区域对 应细胞有重要影响。 病机理 犬数种淋巴组织和肠粘膜细胞中复制，病毒引入途径和起始复制位点在鼻口咽部位，包括扁桃体和其它淋巴组织（ 1987） 。动物可经非肠道的实验方式感染，然而口腔是最主要的自然感染方式。病毒以病毒血症的方式扩散， 1 3 天后可出现在扁桃体、咽淋巴结、胸腺和胸淋巴结。感染 3 天后。肠相关淋巴结组织也有病毒出现。因为病毒于肠粘膜上皮细胞的吸收作用无关，且肠粘膜上皮细胞感染发生在病毒血症后，这中国农业科学院硕士论文 前 言 4 时才意识到病毒感染的重要性。因此，中和抗体进入循环系统能减小感染的肠粘膜范围，但抗体水平不是很高时不能阻止感染。这一现象与疫苗作用相关，灭火的疫苗可在数个月内阻止疾病发生，但不能抗拒严重感染。细胞 因子在 染中可能发挥重要作用，但目前没有相关报道。 细小病毒病的 流行病学 起源和 进化 不断出现的新病毒潜在致病性给人类和动物不断的威胁。猫细小病毒（ 导致的疾病主要集中在猫和浣熊上。直到二十世纪四十年代中期，当一种小病毒在水貂上导致高致死率而被发现后，病毒的发现者，将其命名为水貂肠炎病毒（ 用 常规方法难以区分 克隆抗体将 成三种抗原类型， 1983； 1984）。在七十年代末，在犬中出现另一种病毒，这种新病毒叫犬细小病毒 （命名为 这种细小病毒在全世界范围迅速传播，并且引起成千上万只犬的死亡 (1995)。 出现之后，通过单克隆抗体又鉴别到两株新的变异株，命名为 两种新型病毒不断在世界范围内出现，几乎代替了 。 2000 年 报道在猫体内出现和流行一种 新的细小病毒抗原型 种变异已被证实能减少病毒感染犬细胞的能力，并且增加病毒在环境中的稳定性。 尽管准确的进化机制不清楚，这些新出现的 原型，能够归因于是 抗原病毒在犬体的适应。有趣的是，每一个新的抗原型具有至少一个与以前血清型相同的中和表位（ 1994）。 进化过程成为病毒进化的典型模型。 初是在 1978 年分离到（ 1979）。 血清学回顾溯源试验显示， 1976 年收集的血清中存在有阳性样品。综合各种对 子进化 研究结果发现，病毒的出现至少要提前 10年（ 2005）。 认为是一种来源于 宿主变异病毒。人们提出了各种关于病毒来源的猜测， 最为接受的有两种观点一：认为 源于 变异株（ 1995， 1998； 1999， 2006） ；观点二：认为是 经由非驯养的食肉目动物演变为适应新宿主犬，比如 貂 、狐狸。由于动物在田间被圈养在高密度下，大部分研究者更倾向于后者 （ ， 1998； ， 1998） 。 一些有趣的发现支持 后一观点：通过分析 因序列， 缘关系较 （ ， 1998； ， 2000）。更重要的是， 1983 年从芬兰北极狐狸分离出的病毒株蓝狐细小病毒（ 表现出 间的特征。在 列中， 三个同义的核苷酸改变，这三个载 特殊的。并且依据抗原性，狐狸的细小病毒划分为 。这些发现表明，在犬科动物的家族中，一些动物如貂和狐狸 ，易于感染 病毒的这些动物有可能作为 先的贮存体。最近， 道从德国红狐狸体内分离到一类似 间体细小病毒的中国农业科学院硕士论文 前 言 5 序列，具有一个 殊的非同义置换。尽管这种红狐狸细小病毒有可能来源于传统的 一位点的天然突变，这表明德国的红狐狸可能是 直接祖先。 缘关系很近，分别是各自宿主犬猫重要的病原。 染犬和犬科动物如狼、北美山狗、南美山狗、亚洲浣熊，但不感染猫。 病毒能感染各种猫以及水貂、浣熊 也可能感染狐狸，但不感染犬。然而仅能感染猫的病毒（ 仅感染犬的病毒（ 间的界限不能像原先的犬病毒那样确定。 于急性型，在自然中被新抗原型的 代，感染或在犬猫中复制，或是在两者间转移。毒表面蛋白的氨基酸序列是决定细小病毒宿主范围的基本因素 , 仅