【毕业学位论文】（Word原稿）香蕉NPR1基因片段的克隆及对水杨酸的早期应答反应生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 香蕉 因片段 的克隆及 对水杨酸的早期应答反应 ts ts I 摘 要 香蕉是世界第四大粮食作物，也是倍受人们喜爱的热带水果， 影响 香蕉生产的 真菌病害 有枯萎病、黄叶斑病、黑叶斑病等，尤其是枯萎病 4 号小种，危害严重，造成毁灭性损失， 目前尚无理想的防治药剂，迫切需要培育抗枯萎病的香蕉品种， 但是栽培香蕉多为三倍体，难以通过有性杂交的方式改良，抗病基因工程为改良香蕉对枯萎病的抗性提供了新的途径。 系统获得 性 抗性是指植物在受到病原菌攻击后， 诱导植物产生的系统获得性抗性，提高植物的防卫反应强度或加快防卫反应速度，从而提高未侵染组织的广谱抗病能力， 系统获得抗性途径中的关键 调控基因，过量表达该基因的拟南芥表现出广谱抗病性。本项研究选用抗逆性强，尤其是高抗香蕉枯萎病的中山大蕉，克隆其中的 因，获得了以下初步研究结果： 利用同源克隆技术从中山大蕉中克隆了 径中的重要调控基因 片段，发现在香蕉中共有 2 类 源序列， 1 条 208 1 条 202 别命名为 核甘酸同源性为 与拟南芥（ 同源性分别为 和 氨基酸同源性 与拟南芥的同源性分别为 和 这 2 段基因片段与其它的 因片段有着较高的核苷酸和氨基酸同源性，可以确定已经获得了中山大蕉中的 源 基因。 利用半定量 测结果显示， 是表达量较低，经水杨酸处理后，在 24 48 72表明中山大蕉 助于激活下游防卫基因的表达，从而产生系统获得抗性。 关键词： 香蕉，枯萎病，系统 获得性 抗性，水杨酸 is in it is a of is by of in f. ) is As to of of to is is to be to of of in of to of a is is by is to it its to a of is of to a of In we a as We AR 0208of , of . of , of . a to It is we in we o in A CR is in is A 4h it to 8 it 2h A is as It is A it of 录 摘 要 . I . 一章 引言 . 1 香蕉与枯萎病互作的分子机理 . 1 影响香蕉生产的主要病害 . 1 香蕉枯萎病的致病机理 . 1 香蕉对枯萎病的抗性机制 . 2 香蕉对抗枯萎病的遗传 . 3 香蕉内源抗病基因 . 3 影响香蕉抗病性的因素 . 4 植物抗病机理 . 4 植物的 R 基因与病原物 因的互作 . 4 系统获得性抗性（ 研究 . 10 诱导性系统抗性（ . 14 植物防卫反应信号传导关键基因 . 14 本研究的目的意义 . 21 第二章 材料与方法 . 22 料 . 22 法 . 22 第三章 结果和分析 . 28 蕉 提取 . 28 山大蕉 因片段的获得 . 28 基酸序列同源性比较和分子系统进化树分析 . 29 山大蕉对 应答反应 . 30 结 论 . 33 参考文献 . 34 致 谢 . 43 作 者 简 历 . 44 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 1 第一章 引言 香蕉与枯萎病互作的分子机理 影响香蕉生产的主要病害 香蕉属芭蕉科 (芭蕉属 ( 学名 是一种倍受人们喜爱的 热带水果，也是第四大粮食作物，世界年产量达 吨（ 我国 2001 年香蕉种植面积达 公顷，总产量 吨，居全球第 5 位，为国民经济的发展做出了重要贡献。 香蕉生产上的主要病害有真菌性的枯萎病、叶斑病和病毒性的束顶病（何自福，等， 2000）等，严重的威胁着 香蕉产业。尤其是近年出现的香蕉枯萎病 4 号小种危害性更大，造成毁灭性损失（ 1990）。 香蕉枯萎病（ 称巴拿马病（ 是由镰刀菌古巴专化型 f. 起的土传维管束真菌病害，病原菌厚垣孢子在土壤中可存活几年到十几年，病菌从根部入侵，在香蕉木质部发展，堵塞维管束并产生毒素，使之坏死，该病致病力强、蔓延速度快、感染率和致死率高、危害巨大。依据病菌在不同类型香蕉品系或者不同属种的致病程度可将该病原菌划分为 4 个生理小种。枯萎病 1 号小种曾在 50 年代毁灭了中、南美洲的大片蕉园，使口感最好的大密哈（ 绝 ， 由于抗枯萎病品种 出现才渡过了这场危机。但近年出现的枯萎病 4 号小种可感染所有的栽培香蕉，造成毁灭性损失（ 1990）。我国香蕉主产区广东、海南、福建等地均已发病，而且传播速度快（刘绍钦， 等，2001；林时迟， 等， 2000；蒲金基，等， 2003）。目前尚无防治该病的理想药剂。生产上大面积种植的香蕉也都不抗枯萎 病 4号小种，因此迫切需要培育抗枯萎病的香蕉品种，但是由于栽培香蕉为三倍体，不育、不结实，难以通过有性杂交的方式改良 (裴新梧，贾士荣， 2006)。 香蕉枯萎病的致病机理 病原菌侵染植物可分为三种基本类型：坏死营养型（ 活体营养型（ 半活体营养型（ 针对不同的类型，植物表现出不同的抗性模式。香蕉枯萎病病原菌在土壤中营兼性寄生，它的腐生能力使得它可在土壤中长期生存，在植株残株上也可以生存。这些真菌以菌丝体或 3 种孢子 （ 小型分生孢 子、分生孢子、厚垣孢子 ） 中的任何一种存活。尖孢镰刀菌的孢子萌发管或菌丝体的侵入部位为植物根部，可直接从根尖、根部伤口或是在侧根生长点进入植株体，一旦进入植株体内，菌丝体就在根皮层细胞间生长，当菌丝体到达木质部后，通过木质部的纹孔侵入导管，而后在导管中向上生长，至植株的茎和顶部，病原菌丝体生长过程会产生分枝，生成小型分生孢子，小型分生孢子顺着导管从下往上移动，当小型分生孢子萌发时，菌丝体会穿透木质部上层壁，在相邻的导管中产生更多的小型分生孢子。同时，尖孢镰刀菌也会中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 2 通过木质部的纹孔横向进行进一步扩展。由于病原菌 在植株维管组织内的生长，植株的营养和水分供应受到了很大的影响，导致叶片气孔的关闭、萎蔫和植株的整体死亡。这时，病原菌侵入植株的软组织，直至最终到达死亡组织的表面，在那里大量地产生孢子，这些孢子又成为病原菌进一步扩散的接种体（刘波，等， 2004）。 香蕉对枯萎病的抗性机制 植物抗病性是许多复杂机制协调的结果，涉及到形态结构、生理生化和基因表达调控等各个层次，根据这些抗病因子与病原物的侵染关系可以分为被动抗病因子和主动抗病因子两类，前者包括植物形态结构因素和细胞结构因素。香蕉抗枯萎病机制目前尚不十 分清楚，现有的研究资料表明，香蕉对枯萎病的抗性可能主要来自于两个方面：其一，寄主维管束细胞端壁对病原菌孢子随液流移动的阻碍作用。其二，病原菌侵入后，诱导香蕉根系产生一些防卫反应。 胞结构抗病性 感病 香蕉品种根系创伤接种病原菌后，病菌孢子能够侵入维管束内，并随液流沿导管移动，孢子移动距离在幼根中比在老根中短，而且在抗病品种的老根中，孢子的移动距离显著小于在感病品种老根中的距离，但菌丝在抗病或感病品种维管束中的生长速度和产孢情况并无差别，因此推测，生化物质对病原菌的直接抑制作用可能不是主要的抗病 因素（魏岳荣，等， 2005）。寄主受侵染后最终的抗病或感病表现与侵填体和细胞木质化出现的早晚及其强度有关，在抗病品种中，这种防卫反应出现得早且迅速，而仅靠根系维管束端壁穿孔板对病原菌孢子移动的机械阻碍作用，并不能为抗病品种提供足够的抗性，但却为寄主防卫反应的发挥赢得了时间（蒲金基，等， 2003）。 物诱导性抗性 在侵染早期，寄主维管束产生凝胶和侵填体堵塞导管，从而阻止病原菌的进一步扩展，同时寄主细胞大量合成木质素和纤维素沉积在寄主细胞壁上，这些木质化的细胞同样具有阻止病原菌扩展的作用。用 分离提取自病原菌细胞壁的激发子处理香蕉根系，同样诱发了细胞壁的木质化，同时伴随着过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶和芥子酸脱氢酶等相关酶系的异常增加，说明这些酶系参与了寄主细胞壁的木质化过程（魏岳荣，等， 2005）。 植物的系统获得性抗性（ 一种抵御病原菌侵染的最有效机制，其发生机理是，植物在病原菌 “ 激发子 ” （ 诱导下，形成氧化激增，随后产生过敏性反应（ 经过几天到一周时间，一系列防卫相关基因的表达也随之变化，使 得这种抗性水平逐渐扩展到整株，形成对病原菌侵染的广谱抗性，其特征是外源水杨酸（ 诱导类似的反应。其实质是由于诱导因子使植物产生了系统抗性，在其后与挑战因子相遇时，预先激活的防卫反应对病原菌的入侵就具备了一定的抵御性。发现植物诱导抗性可追溯到 100 年前，早在 20世纪初， 910) 和 901)就认为植物在遭受病原菌侵染后，体内可以产生对病原菌进一步侵染的抗性。随后， 993)报道并详细描述了这种由病原菌侵染而诱导植物产生系统抗病性的现象。 20 世纪 50 年代， 961)证实了烟草、蚕豆等植物通过病毒诱导后，不仅在感染部位获得了抵抗病原侵染的能力，而且在远离侵染部位的组织中也获得了抗性，并把这种现象称为系统获得性抗性 (随着分子生物学研究的发展，对诱导抗性的研究也取得了可喜进展，根据诱导物和信号分子的不同，诱导抗性可分为系统获得性抗性（ 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 3 诱导系统抗性（ 香蕉对抗枯萎病的遗传 关于抗病性遗传 , 根据三个杂交组合， M1 代的抗病性分离比推测， 可能有一个单基因显性因子控制品种 又称 对 1 号小种的抗病性 (et 1965) , 在其它品种和小种组合中抗病性遗传是否如此，还需进一步研究证实。南非以大哈密 ( 或其突变体和 母本 (以 品种 (如 或野生类群为父本，获得抗 4 号小种的杂交品种 和 011962 年推广应用获得较好的防治效果（胡莉莉，等， 2006）。 香蕉内源抗病基因 香蕉是单子叶热带水果，基因组大小 530 拟南芥的 ，由于可食用香蕉都是由二倍体野生种尖叶蕉与长梗蕉自然杂交再经人工选择培育而成，因此香蕉在进化上较为保守，种质资源匮乏。最近，有几个实验室已经开始了香蕉抗 病机理与基因克隆方面的研究 。 R 基因是指基因对基因假说中寄主植物的抗病基因与病原的无毒基因表现非亲和性互作的基因，决定寄主植物对病原菌的专化性识别并激发抗病反应，迄今已经克隆了 50 多个 R 基因，对 R 基因的研究是近年一个活跃的研究领域。 (et 2006)以 守序列设计简并引物，克隆二倍体野生香蕉 抗枯萎病 4 号小种的 R 基因，分离到 5 段 交结果显示在香蕉基因组中均为单拷贝， 析发现 抗病与感病株 中均不表达，而 抗病与感病株中均表达， 抗病植株中表达，在感病株中不表达。 号小种的基因 度同源，用 术获得了该基因的全长，构建表达载体，分别转入抗枯萎病 1 号小种、但不抗 4 号小种的香蕉栽培种 兼抗枯萎病 1 号和 4号小种的香蕉 ，正在鉴定转基因香蕉的枯萎病抗性。 (et 2006) 选用高抗真菌病的二倍体野生种 （ 根据 守区设计 15 对简并引物，分离到了 68 个香蕉 段。 (et 2006)利用 守序列在抗叶斑病香蕉 分离到 13 个与抗病基因 源的序列。杜中军等（杜中军，等， 2005）用 白激酶保守结构域合成简并引物，从巴西蕉（ 扩增到 7 个片段，与报道的 R 基因 较高的同源性。 中国农科院生物技术研究所 (et 2007)在对香蕉中 研究中，发现了不同基因型中山大蕉（ 信宜大蕉（ 、贡蕉（ 信宜野蕉（ 粉蕉（ 泰蕉（ 巴西蕉（ 属于 ： 根据 N 端结构的不同， 基因分为 种类型 (et 002)。双子叶植物的 列中有这两种结构，如在拟南芥中大约有 177 构，其中的 60 个， 构的 117 个（ 2004），而在禾谷类的水稻、小麦、玉米、高梁中只有种类型（ et 2002），已经发现双子叶的甜菜（ et 2004）中也都是中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 4 构，研究结果揭示了香蕉中所有 构均为 于栽培香蕉是无性繁殖，在进化上较为保守，全球香蕉种质资源仅有 1000 多份，因此该结果对于研究香蕉抗病基因的起源、进化以及对香蕉抗病基因的挖掘与利用都具有重要意义。 影响香蕉抗病性的因素 香蕉对枯萎病的抗性除与寄主本身的遗传特性有关外，还可能受到寄主生育期和环境因素的影响。绝大部分香蕉 种类苗期和成株期抗性表现一致，只有 生蕉和 香蕉表现苗期感病而成株期抗病，这为在苗期开展抗病性鉴定提供了理论依据。 号小种，是公认的抗病品种，但在牙买加却出现过几次小规模的病害流行，而两地病原菌致病性并无差异，因此， 为 品种对 1 号小种抗性的丧失可能与逆境，如低温、排水不良、土壤过粘、盐碱化或低 （ et 1972）有关。 研究结果证实 了这一推测，他发现逆境或病原菌接种过量时，在局部地块抗病 的 品种也会表现感病反应 (et 1977) 。 究了土壤缺锌对香蕉枯萎病发生的影响，发现 种在土壤缺锌时，病害严重度会增加，电镜观察发现，病株根系维管束未形成侵填体 (et 1998) 。除此之外，其他病原物也会影响香蕉枯萎病的发生，如香蕉穿孔线虫可以和枯萎病菌形成复合侵染或加重香蕉枯萎病的发生（蒲金基，等， 2003）。 植物抗病机理 植物的 R 基因与病原物 因的互作 1971）的基因对基因假说认为，如果寄主中有一个调节抗性的基因，病菌中就有一个相应的基因调节致病性，其中寄主的抗病基因（ R）和病菌的无毒基因（ 显性的，而寄主的感病基因和病菌的毒性基因是隐性的，只有具有抗病基因的植物品种和具有无毒 基因 的病原菌互作时才表现抗病，其它情况均表现感病 。 原菌的无毒基因 初是根据在含有 R 基因的寄主植物中诱导抗病性的能力来定义的 ， 是指与寄主 R 互作、产物与寄主 R 基因产物互 补、对寄主 植物特异性不亲和的基因，也称为寄主专化性基因或反向调节寄主范围的基因（ et 990）。基因对基因假说的经典解释是受体 般认为 ，无毒基因编码的特异性激发子为配体 ， R 基因产物为受体（ 990），激发子与相应的 R 基因产物识别诱导寄主的防卫反应 ， 从而 表现小种品种互作的不亲和性。无毒基因失活或缺乏相应的无毒基因 ， 则表现为小种品种互作的亲和性反应 ， 植物表现为感病。迄今已从植物病原物（包括真菌细菌和病毒等）中分离获得多种无毒基因。 菌的 因 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 5 目前已克隆了约 40 多种细菌的 因，主要来自假单胞菌 黄单胞菌2000)。它们位于染色体或质粒上，编码亲水性可溶蛋白，且不具有典型的信号肽。尽管已分离到很多细菌的无毒基因，但除 ) 家族外，大部分没有或只有很少的同源性。 因家族 因家族分布于 基因家族成员有以下共同特点： 1)可以在抗性寄主上引起过敏反应 ( 2) 在感病寄主上加重病症； 3)序列同源性很高。 族成员在结构上的典型特征是在其中心区域都含有一个 34 个氨基酸串连的重复区域， C 端含有核定位序列（ 酸性的转录激活结构域（ 基 因家族成员间的不同在于重复序列数目的不同（ ）（ 2001）。重复序列对诱发多数寄主植物的 决定作用， 是激发植物 必 需 的（ et 1996; et 2000），类 变将失去识别相关 R 蛋白的功能（ 2001）。 族 族中最先分离到的成员是源于植物病原菌 源自 et 1997）植物病原菌 X. et 2001)以及植物共生菌 et 1997)。 序列间没有显著同源性的无毒基因主要克隆自 包括一些 克隆自无毒基因，编码小型亲水性蛋白，分子量多数在 18 40有个别产物的分子量高达 100 1987）。 毒的 因 植物病毒的无毒基因编码病毒的重要组分，如：病毒衣壳蛋白，复制酶蛋白和运动蛋白等。 研究发现一种病毒可诱发多种植物产生 种病毒无毒因子可以诱导不同 R 基因介导的胡椒轻型斑病毒的外壳蛋白可诱导胡椒 R 基因 导的 清学上相关性小的不同病毒的外壳蛋白可诱发同一 R 基因介导的 ：烟草花叶病毒（ 黄瓜斑驳花叶病毒（ 外壳蛋白均可诱导毛叶烟（ N介导 的1997)。从寄主角度讲，不同植物中的不同 R 基因，可以分别识别 同种病毒中不同的无毒因子，如烟草 N 基因，毛叶烟（ N基因、番茄 因能够分别识别 制酶（ et 1999）、外壳蛋白及运动蛋白，从而表现 病毒无毒 因子与互补的 R 基因产物也可能通过间接的相互作用导致 抗病反应。用芫箐皱缩病毒（ 子外壳蛋白（ 拟南芥基因文库进行酵母双杂交检测，没有筛选到对 生 R 基因，却发现一种可能是 发子胞内受体的寄主蛋白（ et 2000），这说明 R 可能是以间接作用的方式于 互作用（ et 1998; 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 6 2001）。 菌的 因 由于缺乏简便有效的克隆方法，迄 今只是通过反向遗传法从为数不多的几种真菌中克隆到了一些无毒基因。 番茄叶霉病（ 因是最早被克隆的真菌无毒基因，编码小分子量的胞外蛋白，均含偶数半胱氨酸，在维持蛋白识别结构或直接在蛋白与抗病基因产物的识别中起重要作用（ et 1997）。 在稻瘟 菌（ 克隆得到两类无毒基因。第一类编码品种特异性抗性激发子，迄今唯一克隆的成员是一个编码中性锌金属蛋白酶的基因 et 2000)。第二类无毒基因编码非品种特异性激发子，包括 码产物包括信号肽共 145 个氨基酸，是一种小型富含甘氨酸的疏水蛋白（ et 1995）。 从大麦云纹病菌（ 离鉴定的一种无毒基因，可以诱导多种禾本科作物产生坏死反应，还可高度特异地在含抗病基因 品种中诱发过氧化物酶基因及病程相关蛋白基因 表达（ et 1995），由此推断 与大麦 补的无毒基 因。 其它真菌的无毒基因的克隆也在进行中 。 包括编码豇豆锈病 种特异性激发子基因，亚麻锈病 无毒基因，十字花科黑胫菌 无毒基因 及 无毒基因 （ et 1998; et 2000）。 毒基因在病原物致病性中的作用 无毒基因是病原物的遗传因子，它可 以使相应的寄主植物对病原物的侵染产生防卫反应，这显然不利于病原物的生存和发展。为什么病原物产生一种限制自身的信号，并且在与植物抗病基因一起漫长的进化过程中没有消失？研究表明，无毒基因具有有利于病原物自身生存的功能。 一种无毒基因，该基因的的突变株在番茄叶片中的菌丝生长和分生孢子形成均明显不如野生型（ et 1997）。对大量病原物突变体的分析结果也表明，在寄主不含相关 R 基因时， 因可对病原物提供一种选择优势（ et 2000; et 2001; et 2000）。 同时应当指出，毒性和无毒基因只是人为的命名。无毒基因具有双重功能：在含互补抗病基因的植物中表现无毒效应，而在不含互补抗病基因的植物中则显示小种、菌株、致病型、或种特异性的毒性效应。在细菌无毒基因中，至少有十几个基因在一种或多种细菌菌株，致病型或种中，对不含互补抗病基因的寄主植物表现致病性和毒性作用（ et 2000; et 2000）。 物的 R 基因 R 基因的分类 病原菌在植物体内的特异性识别常常是由单个抗病基因 病基因是指基因对基因假说中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 7 中寄主植物与病原无毒基因表现非亲和互作的基因，它决定寄主植物对病原菌的专化性识别并激发抗病反应。 1992年 ， 玉米抗圆斑病基因 993年克隆了番茄的 (et 1993)。此后 et 1996; et 2000; 2001）。迄今已经克隆了 50多个 006）。大多数 构域（ et 2001; 2001）。根据蛋白的结构特征， 大类：细胞内的蛋白激酶、具胞外 有细胞内 基因、编码与细胞膜结合的细胞外 具有细胞内 R 基因是最大的一类 R 基因。 显著的结构特点是有一个可变的 C 端 经在多种不同蛋白中发现 构域，它是蛋白与蛋白作用、多肽与配基结合、蛋白与碳水化和物结合的功能位点（ 1997; 1998）；此外，每一个 点，这一位点在其他蛋白中对 结合很重要（ et 1990）。 蛋白根据 N 端结构特点可分为两类：一类具有与果蝇胞内信号结构域和哺乳动物白介素 体同源的结构域（ 目前仅在双子叶植物中发现了这类基因，包括拟南芥的 草的 N、亚麻的 基因；另一类包含螺旋 et 2001; et 2001），由于螺旋螺旋结构域的大小及位置差异， 可分为多个亚家族。 R 蛋白的结构与功能的关系 对已知 R 基因序列分析发现，来源于不同作物、抗不同病原物的 R 基因在推定的氨基酸水平上存在几个 保守结构域，如核苷酸结合位点（ 富含亮氨酸重复序列（ 亮氨酸拉链结构（ 丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶（ 跨膜结构域（ 介素 域（ (et 1994; 2004)。 R 蛋白有两种功能：（ 1）病原物识别；（ 2）信号传导，启动植物的防卫反应。 R 蛋白有一个调节结构来确保它们在信号感应转导过程中的功能。水稻的 因和拟南芥编码油菜素类固醇受体的 ）基因产物都包含一个 激酶结构域。将 白的结构部分互换，杂和蛋白中含有 和 激酶区，在油菜素类固醇的作用下，杂和蛋白可激活防卫反应，表明这类 R 蛋白的同源功能域代表了一种功能 性调节因子。 研究发现，在 白中， N 端的 构域参与下游抗病信号的传导（ et 2000; et 2000），而参与特异识别的氨基酸残基大部分位于 C 端的 et 1998; et 2000; et 1999; et 1999; et 2001; et 1998）。 且也参与下游信号传导，如将拟 南芥 因 两个等位基因结构域进行交换，分析两个仅 同的 合体都有功能（ et 2001），这说明不同拟南芥生态型 合体的功能由 定，暗示 与信号传导。 号识别合传导可能需要分子内的相互识别（ et 2000; et 2000）。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引 言 8 守基序及功能 4 个区域组成（ et 2001） ,第一区域为磷酸结合环（ ,又称激酶 1a，跟磷酸脂和 互作用，其共有序列为 G/P） a/T)（ X 为任意氨基酸， a 为疏水氨基酸）；第 2 区域为激酶