【毕业学位论文】（Word原稿）外源基因定向插入甘蓝型油菜C基因组的研究作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 外源基因定向插入甘蓝型油菜 C 基因组的研究 I 摘 要 转基因甘蓝型油菜的环境释放导致外源基因扩散到其野生近缘种形成超级杂草已引起人们广泛关注。加拿大已经在野生白菜种群中发现了抗除草剂外源基因。因此，转基因油菜的生态安全研究重点应在降低转基因向其近缘种扩散的生态风险上，而降低外源基因向 油菜生态风险的关键因素之一。根据芸薹属物种间相互杂交的细胞遗传学研究成果，甘蓝型油菜与白菜和芥菜类植物间有同 源 的 无 同 源 的 色体 。因此，甘白或甘芥杂种在与 染色体重组过程中 有 与其 同 源 的 染色体配对 而 很容易丢失， 即 当外源基因位于甘蓝型油菜 本研究通过将 因组中，以转基因芥蓝（ 2n=18）与非转基因白菜（ 2n=20）正反交， 以 人工合成不同胞质甘蓝型油菜（ 2n=38）的方式，获得 对获得的 胞遗传学、转基因遗传、花粉育性及农艺性状等研究。主要研究结果如下： 1. 通过对影响芥蓝遗传转化的各个条件，如再生体系、外植体种类、农杆菌菌液浓度及共培养时间等参数的优化研究，建立了高效的农杆菌介导的芥蓝遗传转化体系，以子叶为外植体的最高转化频率达到了 以下胚轴为外植体的最高转化频率为 2. 通过白菜和转 用子房培养和胚培养的方法人工合成了分别具有白菜和甘蓝细胞质的 建立了不同胞质人工合成甘蓝型油菜的胚培养体系。 以白菜为母本的正交共获得 75个人工合成油菜株系，杂种苗诱导率（ 反交获 4个株系，杂种苗诱导率（ 3. 31个株系是转基因阳性株系；对转基因芥蓝及人工合成油菜进行基因组 位于人工合成的甘蓝型油菜 4. 对 人工合成的甘蓝型油菜减数分裂行为观察结果表明， A、 减数分裂前期表现分裂速度存在差异，在后期，末期以及第二次减数分裂过程中很少出现染色体的异常配对现象。而人工合成油菜最初几代的染色体结构变化可能更多的来源于基因组内部的易位和重组。 5. 白杂种（ 34%以下）和甘芥杂种（ 28%以下）的育性都低，但甘白杂种的生存适合度高于甘芥杂种。甘白杂种与白菜回交一代的抗性转基因植株比例为 与 步表明外源基因在 续研究工作还在进行之中。 关键词 向转基因；人工合成甘蓝型油菜；白菜；基因扩散；染色体减数分裂行为；转基因安全 A of is to in . to is a of . of of to of . - is B. . a of in A C of is or to . . . 2 . as . by of on as as of as 1. By as of of of so a of 2. of 75 a PR in PR a PR 3. 5 of . in 31 6 PT of of in . to as 4. of . It is in of as , a to 5. of It of of 4% 8% in C1 a to et s. It is 录 摘 要 . . 英文缩略表 . 第一章 文献综述 . 1 言 . 1 杆菌介导的甘蓝类蔬菜遗传转化研究进展 . 2 外植体再生体系的建立 . 2 农杆菌 浓度及 浸染 时间 . 4 农杆菌的活化 . 4 外 植体与农杆菌共培条件 . 4 玻璃苗的控制 . 5 目前较成熟的甘蓝遗传转化体系 . 6 工合成甘蓝型油菜研究进展 . 7 芸苔属属内种间关系 . 7 人工合成 甘蓝型 油菜研究 . 8 人工 合成 甘蓝型油菜 的鉴定 . 9 人工 合成 甘蓝型 油菜的利用 . 9 基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因 扩散 . 10 甘蓝型油菜的近缘种 . 11 开花期和空间重叠 . 11 花粉传播距离 . 11 杂交亲和性 . 12 杂交和回交后代的育性及适应性 . 13 成功的基因 漂移 . 14 小结与展望 . 15 止转基因 扩散 的策略 . 16 雄性不育策略 . 16 孤雌生殖策略 . 17 构 的利用 . 17 母体遗传策略 . 17 . 17 特异 染色体组 转基因 . 17 研究的背景和意义 . 18 V 第二章 芥蓝 的遗传转化 . 20 言 . 20 料和方法 . 20 验材料 . 20 验方法 . 21 果与分析 . 23 杆菌介导的芥蓝遗传转化 . 23 . 25 论 . 26 第三章 C 染色体组转 因甘蓝型油菜的人工合成 . 28 言 . 28 料与方法 . 28 验材料 . 28 验方法 . 29 果与分析 . 32 菜细胞质转基因甘蓝型油菜的人工合成 . 32 蓝细胞质转基因甘蓝型油菜的人工合成 . 32 种染色体加倍效率 . 35 色体观察 . 36 成油菜的 农艺性状表现 . 36 基因检测 . 37 粉育性观察 . 37 成转基因甘蓝型油菜 . 38 艺性状表现 . 38 粉育性 . 39 论 . 40 第四章 人工合成油菜减数分裂中的染色体行为观察 . 42 言 . 42 料与方法 . 43 果与分析 . 44 论 . 44 第五章 C 基因组转基因油菜 向 白菜、芥菜 基因 扩散 规律初步研究 . 47 言 . 47 料与方法 . 48 验材料 . 48 验方法 . 48 果与分析 . 49 1 分析 . 49 1 分析 . 51 . 52 论 . 53 第六章 全文结论 . 55 参考文献 . 56 附 录 . 66 致 谢 . 67 作者简历 . 68 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 酰丁香酮 6 云金芽孢杆菌 苄青霉素 孢 霉素 六烷基三甲基溴化铵 氯异氰尿酸 高 辛 2, 4,4， 4霉素 in 因组原位杂交 种获得率 哚丁酸 哚乙酸 那霉素 新霉素磷酸转移酶基因 密度 合酶链式反应 粉母细胞 乙烯吡咯烷酮 制片段长度多态性 二烷基硫酸钠 NA i E 冲液 瘤质粒 5 维生素 米素 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 言 油菜 具有 适 应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大 等特点，是世界上种植 面积 和 总产 仅次于大豆 的 第二 大油料作物。据国家统计局国际统计信息中心统计， 2000年全世界油菜收获面积为 104产量为 104t，平均单产为 1472kg/中国是世界上油菜种植、加工、消费大国， 常年 种植面积 约 1亿亩（ 667万 公顷 ） ，年产量 约 1000万吨 ，居世界第一位 。 而且，当前随着对能源需求的日益增加，随着 生物柴油 产业化的发展，必将推动作为生物柴油的理想原料 油菜产业进一步的快速发展 。 植物基因工程技术打破了物 种之间的生殖隔离，使遗传物质在动物、植物和微生物三界之间进行交流，利用此技术可在分子水平上定向重组遗传物质，创造新的种质，开辟了新的植物育种的新途径。 农业生物技术应用国际服务组织（ 布 的 2005年度 报告 指出，自 1996年 转基因 作物首次商 业 化以来，全球 转基因 作物种植面积从当初的 6国 170万公顷增加到 2005年的 21国9000万公顷 ， 2005年 比 2004年增加了 11%。世界转基因作物的总市值 也在 不断增加， 2005年转基因大豆、玉米、棉花和油菜等 4种主要转基因作物的总市值已经达到 计 2006年将突破 55亿美元。 报告指出， 混合基因产品将成为未来的发展趋势。 2005年，美国已开始种植第一种 3基因产品 玉米。 中国从 1997年开始批准转基因作物，到 2005年，转基因作物种植面积已达到330万公顷。 油菜是农艺学上的名词，凡是栽培的十字花科（ 薹属（ 物用以收籽榨油的，统称为油菜。因此，油菜不是一个单一的物种，当今世界各国栽培的主要是甘蓝型油菜（ 是目前转基因植物中研究最多的一类植物。自 1996年转基因油菜批准环境释放以来，已经从 1996年 的 10万公顷增加到 2005年的 460万公顷。在国外 ， 至少有 77个转基因油菜品种已经在加拿大等国商业化生产 。 商业化转基因油菜的分布主要在加拿大和美国 。 近年来，加拿大转基因油菜面积达 油菜 总面积的 70%。 美国油菜种植面积也在逐年增大，转基因油菜的面积约占 30%左右 。 我国目前还没有转基因油菜的商业化种植，但油菜的转基因研究相当活跃，油菜的遗传转化技术已经比较成熟。油菜转基因研究已有几十例成功报道，有的已进入环境释放和生产性试验阶段 。 浙江省农科院培育的转基因油菜 “超油 1号”和“超油 2号”已 顺利完成中试和环境释放试 验 。同时也允许转基因油菜籽作为原料的进口 。 孟山都公司的抗农达（草甘膦）品种 个抗除草剂品种 (和 于 2004年通过我国安全评估并获得加工原料进口许可。因此，如何降低转基因油菜的生态风险已成为我们当前中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 2 迫切需要解决的重要课题。 杆菌介导的甘蓝类蔬菜遗传转化研究进展 农杆菌介导法是甘蓝类蔬菜进行遗传转化最常用最成熟的一种方法。 1985)利用野生型根癌农杆菌感染甘蓝的茎最早得到转化植株。 (1988)使用野生型发根农杆菌和根癌农杆菌介导最先获得花椰菜转基因植株。 1989)利用发根农杆菌首先获得了羽衣甘蓝转基因植株。芥蓝、青花菜和抱子甘蓝转基因植株的首次获得也均是基于农杆菌介导完成的。 叶和下胚轴，建立了青花菜和甘蓝良好的转化体系，外植体最高转化率是 10。毛慧珠 (1996)等以带柄子叶作为外植体，将 转化频率很低，被侵染的外植体中只有 5可在抗性培养基上分化成苗。李大力等（ 2002）通过甘蓝下 胚轴与根癌农杆菌 含 25黄科等（ 2005）建立了青花菜的遗传转化体系，转化率达到 然而，这其中的许多报道在基因转移或植株再生中的一个或多个环节中仍然存在未能克服的问题，许多体系仍然存在着一些不足。 农杆菌介导的甘蓝类蔬菜的遗传转化效率与许多因素，如外植体的基因型、取材部位、取材时间、再生培养基、农杆菌浸染浓度、共培养时间、延迟培养基、延迟培养时间、选择培养基、抗生素的使用等都有较大的关系。 植体再生体系的建 立 再生体系对于农杆菌介导的遗传转化至关重要。外植体对再生条件的要求，特别是对培养基中激素配比的要求会因外植体生理状态不同而发生变化，而其生理状态又与基因型、外植体种类、取材部位、苗龄、生活力、生长条件等有关。因此，在进行遗传转化再生时，由于农杆菌的侵染、抗生素除菌和筛选，会使外植体的生活力明显减弱，而对再生的激素配比及其他再生条件要求也可能发生一定的变化。但一般认为，当外植体再生效率高时，则会增加转化效率。 1997）研究认为，转化率可能依赖于高再生力和高感染率。因此，建立良好的外植体再 生体系仍然是提高遗传转化效率的有效途径。目前，对转化再生的研究主要通过两步进行，首先建立再生体系，然后再研究侵染农杆菌后外植体的培养条件对转化率的影响。 植体 外植体的基因型、苗龄、培养基、激素、培养时间等都会影响外植体的再生效率。一般认为，当外植体再生效率高时，则会增加转化效率。 外植体的品种基因型对芽分化的影响十分显著。 大量研究表明：植物的不同基因型品种是制约其分化能力的重要因素（杨广东， 2002b；李聪， 1989）。 1997）的研究认为基因中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 3 型是转化中最重要的因素。 我们对 30个甘蓝及甘蓝型油菜品种进行的再生实验结果也表明，基因型对再生频率影响较大（待发表）。因此在遗传转化实验前，一般进行再生预实验进行在特定培养基条件下的品种筛选，以确定再生频率高的品种从而进行遗传转化。 不同的外植体的分化频率与取材时间也有较大相关性。当以子叶为外植体时，则取 4当以下胚轴为外植体时，以 5 7革志等（ 2001），卫志明等（ 1998）研究认为，以下胚轴为外植体时，取 6 7淑平等（ 2002）以夏光甘蓝的父母 本为受体研究认为， 5 6科等（ 2005）对青花菜的再生研究结果表明，培养 7 中以 7的下胚轴诱导不定芽的频率最高，为 100%，苗龄少于 6 张七仙和敖光明（ 2001）以 6个甘蓝品种为转化受体的研究认为，甘蓝外植体的长度和培养天数对愈伤组织的形成影响很大：下胚轴太长 (1.0 太短 (0.1 不利于愈伤组织的形成，即使有愈伤组织形成，但分化芽很难，而 组织，其中生长 4d 80均可形成抗性愈伤组织；对于子叶，无论大小，在这种培养基上其愈伤组织都很难形成愈伤组织形成的难易，在 6个品种之间差别不大。 养基 一般采用 作为基本培养基，对于芽的分化还要附加一定的激素，常用生长素 (细胞分裂素 (6一定量配比。一般利用组培筛选得到的最佳培养基应用于转化实验。但王晓峰等 (2000)在多个甘蓝品种上的试验表明子叶柄和下胚轴受农杆菌侵染后再生比常规组培需要较高的生长素浓度 。 卫志明等（ 1998）以 103和 60天早椰菜 的下胚轴进行试验结果表明，当培养基中分别含有.5 ， .0 ， .1 或 .0 ， .0