【毕业学位论文】（Word原稿）UMSCs对U87MG细胞生物学行为影响的研究

兰州大学硕士学位论文 871 第一章 前言 恶性胶质瘤（ 脑内最常见的恶性肿瘤，属于神经上皮肿瘤，其发生率在脑肿瘤发病中占 40具有发病率高、复发率高、死亡率高、生存质量差、治疗难度大等特点。其治疗一直是困扰神经外科医生的难题，如何找到切实有效可行的治疗手段，一直是广大神经外科医生研究的方向之一。目前治疗主要以手术治疗为主，配合放疗、化疗及生物医学治疗等手段，但胶质母细胞瘤的生存率仍不能达到两年 1 自上世纪 70 年代以来，科学家经过大量实验研究证实，在脐带基质（间充质）中以及哺乳类动物骨髓基质中存在具有能分化形成骨、脂肪、软骨以及神经等细胞能力的多分化潜能的细胞亚群，将其称为间充质干细胞 （ 4。研究发现在脐带基质中不但存在具有多向分化潜能的脐带间充质干细胞（ 还存在在大量的血细胞、单核细胞及造血干细胞 5。研究发现 不具有排斥性，伦理问题也较少，越来越多的受到科研工作者的关注，已研究应用于许多功 能缺陷型疾病、器官组织退行性病变、遗传性疾病以及某些恶性肿瘤的诊断治疗当中，还应用于某些基因工程及组织工程领域的研究 6，但其对恶性肿瘤是抑制、促进还是向正常组织细胞诱导分化目前还处在实验室研究阶段，对恶性肿瘤的治疗研究还未应用于临床。 通过大量的体外研究及动物实验研究发现，间充质干细胞为理想的生物治疗手段，已有相关报道证实间充质 干细胞能够抑制肿瘤细胞的生长分化 7。细胞生物学及分子生物学方面的大量研究已近对共培养可能的机制进行了大量研究探讨 8，研究证实体外干细胞与肿瘤细胞共培养有以下机制：（ 1） 活蛋白激酶而作用于相应受体的的旁分泌机制；（ 2）细胞 9；（ 3）缝隙连接机制，缝隙连接是干细胞增殖分化过程中必须的机制或过程。 本实验通过 外培养及鉴定方法建立的基础上，研究探讨 究探讨 恶性胶质母细胞瘤细胞 系 （ 直接或间接共培养可能产生的结果，观察 胞形态、细胞周期及超微结构改变等的影响，分析 胞生物学行为的影响作用，总结 培养方法 与经验 。 为进一步研究提 供方法和基础。 兰州大学硕士学位论文 872 第二章 材料与方法 验材料 足月健康新生儿脐带一根 （肝炎系列、 传染指标均为阴性） ，由兰州军区兰州总医院产科提供。 人恶性胶质母细胞瘤细胞 主要试验仪器 磨砂载玻片 （ 江苏海门 ） 恒温烤箱 (上海跃进医疗器械厂 ) 光学显微镜 （日本 司 ） 恒温水浴箱 (江苏仪器厂 ) 灭菌锅 （上海） 移液器 （美国 ） 荧光定量 (加拿大 ) 微波炉 （美 国 ，中国） 4冰箱 （海尔，中 国） 温冰箱 （ 国） 物显微镜 （ 本） 增仪 司 胞培养箱 置相差显微镜 ( 外分光光度计 式高速冷冻离心机 式细胞仪（ 国 养版 主要试剂 养基 （ 美国 司 ） 胎牛血清 （ 杭州四季青生物工程研究所 ） 重组人碱性成纤维细胞生长因子 北京双鹿药业 (逆转录试剂盒 (连宝生物公司 ) 兰州大学硕士学位论文 873 I 凋亡试剂盒 司 胰蛋白酶 美国 司 荧光定量 （ 司） 兔抗小鼠 （ 兔抗小鼠 （ 磷酸盐缓冲液 (司，美国 ) (美国 氯仿 (上海化学试剂公司 ) 异丙醇 (上海化学试剂公司 ) 无水乙醇 (上海化学试剂公司 ) (大连宝生物 ) 荧光定量 剂 (大连宝生物 ) (大连宝生物 ) (大连宝生物 ) 物公司 物公司 物公司 记山羊抗兔 兰州博研生物有限公司 苏木子 北京中杉金桥生物技术公司 台盼兰 上海化学试剂分装厂 司，美国，上海化学试剂厂分装 司，美国上海化学试剂厂分装 司，美国 ,上海化学试剂厂分装 液的配制 按 标 准 配 方 配 置 的 称 取 2 将上述试剂依次溶解于 800 搅拌 ，使试剂充分溶解 ，调节 至 补加 1000匀 ， 将其分装入盐水瓶中，10钟高压蒸汽灭菌， 4冰箱内 保存 备用。 用水配置 液， 分装备用。 用无菌 液调节 至 兰州大学硕士学位论文 874 胞培养液的配制 拆开包装后，将干粉型培养基溶于欲配置液体 800，冲洗包装袋两次倒入培养液中，加入磁性搅拌棒置于磁性搅拌器上充分搅拌，确保培养基干粉充分溶解； 倒入 1L 容量瓶中，加入 加入抗生素：按青霉素 100u/霉素 100ug/ 按 10%加入经 56灭活的胎牛血清，补加 近 1000 调节 至 用 m 和 膜 各一张，高压蒸汽灭菌后，将上述溶液加入滤器过滤除菌； 将过滤除菌后的培养液分装于贴有标签的无菌储液瓶中，加盖，封口膜加封瓶口， 保存 于 4冰箱内备用。 胰蛋白酶消化液的配制 称取 1： 125 的胰蛋白酶粉末 加入 100 磁力搅拌器搅拌混匀，使之完全溶解； 加入 20上述溶液； 过滤除菌，分装保存于 4冰箱内备用 。 碘化丙啶（ 配制 称取 橼酸钠 加 100 保存于 4冰箱内备用 。 离、培养与鉴定 离、培养 （ 1） 高温高压消毒手术器械及玻璃器皿，操作遵循手术无菌操作原则。 （ 2） 取足月健康新生儿脐带一根，洗净后浸泡于 25u/素钠，100u/100mg/霉素）中 2时。 （ 3） 超净台内取出脐带，将其切成 2除动脉、静脉及外膜，在将其剪成大小约 于加有 10%胎牛血清的 养基的培养皿中， 部分加入含 10%胎牛血清（ ,终浓度为 20ug/ 养基， 将其 平 置于 370C、 5%全湿条件培养箱中 进行组织块贴壁培养 。 培养瓶盖在旋紧后再旋松一周，使 够进入培养瓶，定期观察细胞生长情况。 （ 4） 培养 7 天左右，细胞自组织块周围逐渐爬出，每隔 72时全量 含兰州大学硕士学位论文 875 10% 浓度为 20ug/l 养基 全量 换液一次， 每次换液用 5冲洗培养瓶底细胞层 3遍，弃去废液；每隔 48眼观察培养基由红转黄后进行全量换液。 （ 5） 待细胞变形生长大 70右时，用 蛋白酶 /于370C、 5%养箱 消化 1倒置显微镜下观察细胞胞体回缩变圆，贴壁细胞脱落后， 加胎牛血清终止消化过程 ， 加培养基小心吹打，待细胞自管壁完全脱落 。 （ 6） 将 培养瓶内 细胞悬液移 至无菌 离心管内 1200 转 /心 5 分钟，弃去上清， 载加入生理盐水或 分弃去细胞碎片及死亡细胞。 （ 7） 加入 1细胞吹打混匀后 ，进行细胞计数，依据细胞数量 以1:2 比例传代培养，标记为 同样方法将细胞传代培养至 式细胞仪鉴定。取对数生长期细胞 细胞用于实验。 定 （ 1）将 悬 ， 使细胞分散， 用 进行冲洗； （ 2） 将单细胞悬液进行离心，弃去上清，重新悬浮于 50C 预冷的盐水中 ； （ 3） 缓慢加入 5%乙醇 15其终浓度为 70%，冰浴30 40 （ 4）将固定后的细胞加入 5悬，将其配成 1 （ 5）将等体积的细胞悬液与 液混合， 400 （ 6）将样品用 300目尼龙膜过滤。 （ 7）将样品加入 美国 司生产的（ 样品室，以激发波长 488定，用 V 分析软件对 胞周期进行分析，检测前用标准样品调整 在 2%以内。 87养 (1) 胞由兰州大学医学实验中心魏虎来教授馈赠。 (2)将冻存于液氮中的 的细胞用 37摄氏度温水复苏后，将其移于加有 2倍于细胞冻存液的 养基的离心管中， 1200转 /分离心 5分钟弃去上清，防止细胞冻存液中的 细胞贴壁造成影响。 用生理盐水或 其进行冲洗再离心，弃去废液，加入 10% 进行细胞计数 。 (3)按细胞数量按比例 接种于含 10%胎牛血清的 养液中， 将培养瓶平 置于 370C、 5% (4)取对数生长期细胞用于实验。 兰州大学硕士学位论文 876 培养体系建立 清液 与 培养 （ 1） 收集 清液 ： 4 代细胞传代培养。 （ 2） 待 满培养瓶壁 80%时，用 10%量换液，继续培养 72小时后，收集其上清，将其用 10% 原液、 1:2、 1:4及 1:8稀释备用。 （ 3）解冻复苏 种于培养瓶中，用 10% 370C、5% （ 4）待细胞长满培养瓶壁后，用胰蛋白酶消化发将细胞消化制成单细胞悬液，计数 其稀释呈浓度为 1l 的浓度，分别以 1接种于 24孔板。 （ 5）加入 10%养 72小时，细胞长满培养板 80%，弃去上清，用 （ 6）分别在各孔中以原液、 1:2、 1:4 及 1:8加入收集制备的 每组设 4个附孔，并以 （ 7）分别在 24小时、 36小时、 48小时、 60小时及 72小时取出培养板、收集细胞进行实验。 胞直接 共培养体系建立 （ 1）将培养备用的 光学显微镜下进行细胞计数，加入含 10%浓度调整为 1直接共培养工作液。 (2)将上述工作液以每孔 1量加入 24孔板，加盖 置于 370C、 5%全湿条件培养箱中培养 ，并观察细胞形态及生长情况。 （ 3）培养 24 小时后，弃去 24孔板中原培养液，加入新鲜培养液冲洗培养版底部细胞层，将松散细胞及细胞碎片清除，纯化细胞体系。 （ 4） 将铺满培养瓶底的 000r/心 5弃上清液，细胞用 1悬，进行细胞计数， 将 （ 5）将制备的 胞 悬液以 每孔 1 24孔板中进行培养，并定期观察细胞形态及生长情况。 （ 6）分别在第 3天和第 7天取出培养板，分别收集共培养后每孔的培养液，用新鲜培养液将培养板每孔冲洗干净。 （ 7）将每孔中收集的 胞以 1000r/心 5式细胞仪检测凋亡情况。 层培养体系建立 兰州大学硕士学位论文 877 （ 1）将培养备用的 成单细胞悬液，在光学显微镜下进行细胞计数，加入含 10%将浓度调整为 1 (2)将上述工作液 以每孔 14孔 养板上室，加盖 置于 370C、 5%并观察细胞形态及生长情况。 （ 3） 将铺满培养瓶底的 胞吹打脱壁后 1000r/心 5弃上清液，细胞用 1悬，进行细胞计数， 将 细胞悬液 。 （ 4）将制备的 液以每孔 14孔 养板下室进行培养，并定期观察细胞形态及生长情况。保证上下两室工作液通过小室底膜互相接触。 （ 5）将 胞单 纯培养与 24孔板中做阴性对照。 （ 6）将 养板置于 370C、 5%全湿条件培养箱中培养 间接共培养，培养过程中不进行常规换液，定期观察上下两室细胞生长情况及形态改变。 （ 7）分别在第 3天和第 7天取出培养板，分别收集共培养后每孔的培养液，用新鲜培养液将培养板每孔冲洗干净。 （ 8）将每孔中收集的 胞以 1000r/式细胞仪检测凋亡情况。 （ 9）另送共培养前后细胞至兰州大学继续医学院电镜室进行透射电镜超微结构观察。 检测 养上清液对 胞 增殖的影响 (1) 在共培养各组， 按 预定计划 设 12h、 24h、 36h、 48h、 60h 及 72h 5个时间点 。在各时间点 分别在每孔加 5mg/20l， 37 继续孵育 4小时，使 止培养并吸弃上清液； 每孔加 150微升 色， 37 至少静置 30 至过液 )，使甲质颗粒充分溶解，在酶标仪以检测波长 490 取 。 (2) 以时间为横、光吸收值（ A）为纵坐标绘制正常 10%养条件下及不同浓度 用下 胞生长曲线。 (3) 计算不同浓度、不同时间段 胞的抑制率。计算公式为：抑制率 =（ 1D 值 /对照组平均 ） 87胞与 培养后 细胞形态变化 观察 （ 1）分别 将正常培养、以及 培养细胞 72h，在荧光倒置显微镜下 观察 胞 及 共培养前后细胞形态 学变化。 （ 2） 用 培养组细胞， 观察 胞 及 胞形兰州大学硕士学位论文 878 态 变化 。 （ 3）照相留用。 式细胞仪检测 胞与 培养前后 胞细胞周期 变化 （ 1） 收集正常 10%87胞、与 培养后 清液 处理后 胞 。 （ 2） 用 涤细胞 2 次。 （ 3） 用 离心后的细胞沉淀 重悬成单细胞悬液 。 （ 4） 缓慢加入 4 无水乙醇，吹散混匀，使乙醇终浓度达 70%， 密封 4 固定 24h。 （ 5） 1000r/心 5， 弃 去 乙醇， 涤细胞 2 次 ， 100l 次 悬浮细胞 。 （ 6）在单细胞混悬液中 加 色液 300l，作用 15 （ 7） 流式细胞仪测定 量的变化，分析 细胞周期 变化 。 胞细胞 色 （ 1） 取普通洁净盖玻片 数张，置 于 70%乙醇中 浸泡 5立于 无菌超净台内吹干， 高压蒸汽灭菌。 （ 2） 将盖玻片置于 24孔板内，种入 置于 37 、 5%养 24小时，弃去培养液。 （ 3）用 1:2、 1:4和 1:8不同浓度 同时间后，吸 弃 培养液 。 （ 4） 加入 聚甲醛 定 30 （ 5） 吸 弃 固定液，用 次 ，吸尽液体。 （ 6） 加入 色液，染色 5滴加抗荧光淬灭液于载玻片上 ， 用盖玻片封片 ， 尽量避免气泡，使细胞接触封片液 。 (7) 荧光显微镜 下以 激发波长 350发射波长 460检测到呈 绿色的细胞核。并照相备用。 共培养前后 （ 1）取普通洁净盖玻片数张， 泡酸过夜 ,超声波超声清洗至少 2个小时。 （ 2）泡饱和的碳酸氢钠溶液过夜。清洗后泡酒精中，备用。 （ 3）实验前将盖玻片从酒精中取出，立于超净工作台内吹干，高压灭菌备用。 兰州大学硕士学位论文 879 （ 4）在超净台中，打开灭菌完全的饭盒，取出盖玻片， 放入无菌六孔板中 （ 5）将胰酶消化后的单细胞悬液，调整成 1 106个 /种到六孔板中。 （ 6）待细胞长满 80%左右时，进行实验。 （ 7）将六孔板中培养基吸干，预冷的 洗 3次。 （ 8）加入 10%甲醛，固定至细胞发白， 次，每次 3分钟。 （ 9）加入 37 15 分钟（细胞膜打孔，以便于让抗体进入）， 次，每次 3分钟 （ 10）加入 3% 过氧化氢，室温 15 分钟（目的是灭活内源性的 次，每次 5 分钟，防止残余的双氧水灭活二抗上标记的 （ 11）分别加入适当浓度的 上六孔板的盖子， 4度冰箱，过夜。 （ 12）次日， 37 度水浴复温 1小时， 洗 3次，每次 5分钟。 （ 13）加入适当浓度的二抗，盖上六孔板的盖子， 37 40钟， 洗 3次，每次 5分钟。 （ 14） 色，苏木素衬染。 （ 15）脱水，透明，封片，镜检后照相留用。 数据处理 数据分析应用 件包进行统计学分析。生长曲线应用 兰州大学硕士学位论文 8710 第三章 结果 分离、纯化和鉴定 培养过程中形态学变化 脐带常规进行组织块培养，常规 10%液、传代。 将 胞经胰蛋白酶消化后，吹打至细胞完全脱落，将细胞悬液一纸离心管中以 1000r/心 5行细胞计数，以 1细胞浓度用10%7、 5%胞于 1248全贴壁，培养液由红转黄，进行全量换液。 72 小时后见细胞呈巢状生长，细胞成梭形或多角形，以长梭形为主，形状大小各异。96h 120胞增殖加速，生长方向一致，逐渐融合铺满瓶底，细胞增殖开始减慢，细胞变得宽大扁平，细胞老化，出现生长抑制现象（见图 1）。 图 1 A 图为 12h 形态变化； B 图为 24h 形态变化； C 图为 36D 图为 48h 形态变化； E 图为 72h 形态变化； F 图为 6h 形态变化 at ： 2h B: 4h C : 6h D: 8h E : 2h F: 6h 疫 表型鉴定 兰州大学硕士学位论文 8711 流式细胞仪检测传代后 性对照在 ， ， ， ，图 2) 图 2 （ 不同浓度 清液作用下生长曲线及抑制率 抑制作用， 96小时培养后 1:8、1:4、 1:2及未稀释的 清液对 7%， 24%， 且具有时间、浓度依赖性，与对照组（ 胞与 常培养组） 两者之间比较有显著差异。 *P*PS 州大学硕士学位论文 8712 图 3 87MG by 色法结果显示 抑制作用， 96小时培养后 1:8、1:4、 1:2及未稀释的 清液对 抑制率分别为 17%， 24%， 且具有时间、浓度依赖性，与对照组（ 胞与 常培养组） 两者之间比较有显著差异。 共培养前后细胞形态学变化 胞形态 在正常应用 8小时后在倒置 瑞士染色后 观察 细胞清晰呈多角形，呈巢状生长（附图 4A）；在加入 养 48小时后，细胞骨架消失 , 融合成片，部分细胞脱落，胞体收缩变形 （ 附图 4B）。 图 4 （ 887） 87MG in A 8h 87MG ） 共培养前后 2次 养瓶底部细胞伸展变形，成多角形或梭形，折光性好，细胞核较大（ A）。细胞经过继续换液培养2周左右单细胞层逐渐成巢状分布，将细胞消化传代继续培养 12小时，细胞逐渐由圆形变为梭形或多角形，切形态规则，折光性强（ B）；继续培养检细胞增至明显加快， 720%左右（ C）。将 874 下可见 起消失，局部呈铺路石样增殖（ D）。（见图 5） 兰州大学硕士学位论文 8713 图 5 (A 次换液后形态变化； B 培养 15天传代后 12小时形态变化； C 传代后 4D 87) (A B 2 5 C -5 D 87MG 4 流式细胞仪检测细胞周期：在 浓度为 1/2和 1/4 时分别作用12h、 24h 和 48h 后， 定细胞周期结果显示（图 4）：用 1/2 清液培养 2h 后出现亚二倍体峰（ 占细胞总数的 用 87胞 48h 后，出现明显亚二倍体峰（ 占细胞总数的 在 1/2 2h 后 即 可使 期阻滞，87出现了周期阻滞现象（主要为 (%) 87 %) ) *P*PS 胞 细胞 色 细胞 色 是可以穿透细胞膜的荧光染料， 染色后细胞呈绿色，其具有低毒性，不对细胞造成损害， 色常用于检测细胞凋亡， 胞经 染色 后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。 实验 正常 培养的 胞核受紫外光激发 ， 发射出 鲜明 的 绿 色荧光 ， 活细胞呈弥散均匀荧光 ,核质结构清晰 ； 培养 作用 24 胞 形态学特征表现为典型的凋亡细胞形态，其 细胞皱缩 ， 出泡 ， 染色质浓缩 ， 核碎裂 (图 7)。 在荧光显微镜下观察， 胞经 色 的细胞核，以及光学显微镜下细胞形态变化，有如下变化特点：随着共培养时间的延长和 清液 浓度梯度的增加，经 清液 处理组的细胞逐渐显示出典型的凋亡细胞形态学特征， 细胞胞体皱缩，呈圆球形，细胞核呈浓染的碎块状， 24h 更加明显 。 图 7 (200) 87胞经 B： 胞与 清液 1： 4作用后经 C： 胞与 清液 1： 2作用后经 D： 胞与 清液原液作用后经 色细胞核形态变化； 200) A : 87MG B: 州大学硕士学位论文 8715 :4 of C: 87MG :2 of 共培养前后 疫组化检测结果 免疫组织化学染色，培养 1小时后 24h 后 9）。 图 9 共培养后 疫组化检测变化 (州大学硕士学位论文 8716 第四章 讨论 肿瘤是一种多基因、 多步骤突变的进化性疾病，肿瘤细胞的恶性增殖、分化受阻在大多数恶性肿瘤的发病机制中居重要地位 10。临床多种治疗手段均有抑制肿瘤细胞生长的作用，并可阻滞肿瘤细胞某一细胞周期而达到抑制肿瘤生长的作用，但目前常用的放射治疗以及化学治疗均为姑息性治疗手段 11。故研究新的治疗手段对控制肿瘤具有重要意义。 脑恶性胶质细胞瘤是颅内最为常见的原发性肿瘤，其具有治疗效果差，复发率高、死亡率高等特点 12。手术治疗联合化疗、放疗和生物治疗后 3年 13, 14。对于脑恶性胶质细胞瘤的新的辅助治疗，尤其是干细胞的研究是近年来的研究热点。 目前认为，肿瘤的发生与肿瘤干细胞有关。 所有的肿瘤组织并不是由单纯、均一的肿瘤细胞所组成的，在肿瘤组织中不同的细胞具有不同的增殖、分化、浸润和转移能力，亦即肿瘤的异质性。其中存在少数担当着干细胞角色的肿瘤细胞具有干细胞的基 本特性：包括自我更新能力、无限的增殖能力和多向分化潜能，近年来被学者称之为肿瘤干细胞 （ 。在神经系统中，有很强的自我更新能力，那么在增殖、更新过程中就有可能因外界外环境等因素影响使基因发生突变，干细胞分化走向发生变化引起恶变，且干细胞在神经系统中生存时间较长，其发生突变的机会更多，最终形成具有诱发肿瘤发生的干细胞，即 5, 16。 在临床研究方面，有学者通过 间充质干细胞（ 共培养 能明显降低代表细胞分裂的活性物质细胞周期蛋白 1）、 表达，同时可分泌更多的免疫反应蛋白，如白介素 及 肿 瘤 坏 死 因 子（ ，说明改变 环境可有效抑制其分化增殖，可推定对胶质瘤治疗可能有效。 有学者认为，同时调节神经干细胞增殖和自我更新的基因在 择巢蛋白（ 标志物进行胶质瘤起源的研究，发现在实验鼠的室管膜下区存在 着时间增加，这些细胞转化为实体瘤细胞，为 有学者认为单一细胞经过一定周期的突变后也可向恶性转变，如 17认为单一细胞经过 4织更新越快，基因复制、转录、翻译过程中发生突变的几率就越高， 易在分化过程中发生突变引起恶性变，可能转化为 于是星形细胞瘤、兰州大学硕士学位论文 8717 少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤还是室管膜瘤取决于转化过程中 有推测认为它可能起源于已分化的细胞 ,由这些细胞突变发生去分化得来 ,并通过基因突变而获得了干细胞自我更新的特性 ,从而形成 前 来也有学者提出 可能是有不同的 18，这些亚群主要区别在于其表面标志物、逃逸能力、诱导供瘤血管生成能力及迁移侵袭能力等方面，且不同的干细胞亚群在肿瘤生长发生中充当不同角色，这也说明 在病理类型上有不 同的差异。但这些起源均为一些学说或假说，尚不完全肯定。 没有确切理论支持，还需要进一步进行研究。其表面标志物 有些 不代表其不是 有待发现更多新的标志物来鉴别进一步研究提供帮助。 不管基础研究从哪个方向、用哪种方法，其最终目的都是为临床服务，为广大胶质瘤患者的诊断、治疗及预后提供可行的方法与依据。胶质瘤的诊断和预后判断目前