【毕业学位论文】（Word原稿）拟南芥液泡H+-ATPase B亚基功能初步研究

兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 1 - 第一章 文献综述 动蛋白及微丝骨架简介 肌动蛋白 (真核细胞 中 普遍存在的一种蛋白质 ，分子量为 43000央有一裂口，内有与 合的位点。在体内肌动蛋白以两种形式存在：单体肌动蛋白 (丝状肌动蛋白 (单体肌动蛋白又称球形肌动蛋白，是一条多肽链折叠形成的球状蛋白，它由 375个氨基酸组成，是一种在进化上高度保守的蛋白质。丝状肌动蛋白，又称肌动蛋白纤维 (它是 肌动蛋白单体头尾相连呈螺旋状排列而成 的 ，直径 为 7 双股螺旋状 (2006)。 真核细胞中的细胞骨架是由微丝 (微管 (中间纤维 (同构成的，它的高度动态性是适应细胞形态发育、维持大多数细胞生命活动所必须的。微丝（即 肌动蛋白纤维 ） , 广泛存在于真核细胞中， 具有高度有序性，它在细胞运动、细胞形态建成以及物质运输等诸多生命活动中 发挥重要作用，是细胞骨架的重要组成部分。微丝骨架 (是 一个高度组织化和动态 化 的结构 ， 并参与许多细胞过程， 如 细胞内的运输 、 细胞生长 、 细胞分裂 、 细胞质流 、 细胞器定位 、 细胞与细胞之间的通讯 等 (2000； 2000； Li et 2001； et 2005；2009)。 肌动蛋白分子上的裂口使其在结构上具有不对称性，以及组装、核苷酸水解和无机磷的释放 等一 些 滞后现象，赋予了 微丝 极性。在整根微丝上每个单体的裂口都朝向微丝的同一端，具有裂口的一端为负极 (-)，另一端为正极 (+)， 新的肌动蛋白单体加到微丝的端点，就造成微丝的延伸。在体外组装过程中， 微丝 的正极 (又称延伸末端或刺状端 )是 体肌动蛋白结合的优先位置， 微丝 因 肌动蛋白单体的不断添加而延长， 微丝 的负极 (又称突出 末 端或缓慢延伸末端 )是 微丝 因 肌动蛋白单体的去组装而缩短 (2006)。 单体肌动蛋白聚合形成微丝过程可以分为三个阶段： 成核期 (生长期 (平衡期 (成核期是由激活的肌动蛋白单体两两聚合形成 二聚体，然后再聚合成由 3亚基组成的多聚体，这就是微丝组装的核心 ( 然后进入快速生长期。生长期是单体肌动蛋白结合 合形成微丝片段，它形状如箭头 , 其一端被称为正端 (另兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 2 - 一端被称为负端 (微丝的生长延长主要受 调节 , 结合 成 它 对微丝的正端有更高亲和力，导致微丝正端的聚合速度明显快于负端。聚合到微丝上的 水解为 容易发生脱落、解聚，会从微丝负端解离下来 。 肌动蛋白不断从正端添加、从负端解离， 加到微丝上的聚合速率与微丝解聚速率相等 ， 微丝总长度维持相对稳定，整个体系达到一个动态 的 稳定状态即平衡期 (2009)。 动蛋白结合蛋白简介 细胞内微丝的 聚合 和 解聚 动态特性是微丝骨架行使功能的重要基础 , 并受到如微丝结合蛋白、金属离子、小 G 蛋白等 各种因子 的严格控制。与肌动蛋白结合的大量蛋白统称为肌动蛋白结合蛋白 (，微丝骨架通过 调节其 聚合 和 解聚 的动态变化 ， 进一步对 细 胞内外信号做出快速反应 , 参与细胞的许多生理活动。例如一些真核细胞内的细胞过程，就需要包含肌动蛋白微丝和肌动蛋白结合蛋白的复合体，它们可以直接与 合、解聚、稳定、分离、封端、成束和肌动蛋白丝的交联等过程 (2005； 2007； 2010；2010)。 同时， 细胞中 浓度对于微丝骨架组装具有一定作用， 微丝的聚合在高于一定的 度 (临界浓度 )条件下才能发生。肌动蛋白不能简单地由合 变成 此肌动蛋白的解聚并不是简单的聚合的逆过程。在溶液中肌动蛋白结合蛋白 进游离的 溶液中将结合的 速交换 形 成 年 来研究报道了 162 种不同的结合蛋白存在，它们参与 肌动蛋白细胞骨架的重构，根据功能的不同，它们可简单分为以下 7类： (1) 单体结合蛋白，它们可以隔离溶液中的 而抑制微丝聚合 , 如 。 子量为 1215 广泛存在于真核细胞中，具有高度保守性，与生殖和生长相关，在拟南芥多种器官中表达。植物 动物 样，它与 1:1 的比例形成复合体 , 可封存而具有抑制微丝聚合的作用。它也可与磷脂酰肌醇 - 二磷 酸(,5富含脯氨酸的蛋白结合 , 这些细胞信号可影响 微丝骨架的调节功能，与信号转导系统有关 (et 1996)。 (2) 微丝切割蛋白，它们通过结合 一侧将其切割成两段，减小微兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 3 - 丝的平均长度，如 分子量为 1522 所有真核细胞中都表达 , 并且植物细胞中含量更为丰富。 以结合 具有解聚微丝负端功能。 容易结合 微丝正端富集 不能结合上去 。 而在微丝负端， 水解、磷酸基团释放后形成 后 与 速结合，从而导致 速微丝负端的解聚。 仅可以促进体从微丝上解离下来 , 还可结合到释放的 体上 , 抑制 交换。 (et 2001； 2006) 。另一关键功能是切割微丝 , 产生新的开放末端 , 被认为是形成微丝网状结构的原因。 (3) 交联蛋白，它们包含两个或两个以上的 合位点，更有利于形成微丝束、分枝微丝和三维网络结构 , 如 。 拟南芥基因组分析时首次发现植物 复合体，动植物细胞中 的功能是高度保守的 (2005)。它由 7 个亚基组成，包括两种肌动蛋白相关亚 基 及 5 种其他小蛋白 (基 蛋白复合体在体内和体外都可以促使肌动蛋白成核 , 形成微丝侧枝 , 进而连成微丝网络。它影响微丝骨架排布 , 在维持植物细胞形态建成中具有重要作用 (Li et 2003；et 2004)。 (4) 微丝末端结合蛋白，在细胞周期进程中， 微丝 在组 装过程中要经历动态变化。这些组装过程需要特定的肌动蛋白相关的因子 ，包括肌动蛋白结合蛋白和端结合蛋白 ，可以给微丝末端加帽，阻止在微丝负端和正端进行的单体交换，高等植物中一些肌动蛋白端结合蛋白已被鉴定出，分别有 (007)。 (5) 微丝解聚蛋白，它们可以诱导 化为 (6) 马达蛋白 , 它们以微丝为轨道 , 在微丝上面移动 , 如 族 。 (7) 稳定蛋白，可结合到 侧面 , 防止微丝的 解聚 , 如 分类不仅仅使这种单一分类 , 许多 白具有许多不同的功能，例如 有切割微丝的功能 , 同时也可以给微丝正端加帽； 复合体可使微丝成核、延伸 , 并且也在微丝网络中建立分枝点； 以促进成核，也可以诱导平行肌动蛋白丝的聚合，从而形成肌动蛋白束或肌动蛋白索(et 2003； 2006； Ye et 2009)。 兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 4 - 泡 H+分子结构及、亚基功能及生理功能 质子泵 (一种推动质子跨膜运动的能量系统， 存在于几乎所有的细胞中。目前已知的膜质子泵 为三类： +于细胞质膜上， TP 于线粒体上，+于液泡膜上的 。 液泡 H+ 由 动的质子泵， 它 分布于液泡膜和多种细胞内膜系统 中 ，包括高尔基体 囊泡 、突触囊泡、溶酶体、储存囊泡、网格蛋白包被小泡、中心囊泡核内体、分泌小泡、以及多种细胞的质膜中。同时， 存在于肾间质细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和破骨细胞中，并在其中起某些特殊作用 (1997； 2002； 2007)。 有研究得到哺乳动物牛的 复合体 成亚基是 a(41 的组成亚基是 酵母 复合体 组成亚基是 a(4组成亚基是 Xu et 1999； et 1988； 2004; et 2008)。 分子结构与分子装配 一个高度保守的多亚基寡聚复合酶体，分子量约为 560D，由大约 14 个不同的亚基组成具有活性的全酶，其中一部分亚基在单个全酶中存在多拷贝 (et 1996； 2002)。 成“球茎”结构 , 中间存在一个轴型结构域，使 结构和功能联系起来 ： 膜嵌入的，含有质子转移运输通孔； 分子量约 500催化 合和水解 。 少包含 6 种不同的亚基，分子量分别在 17 00 间，有 a、 c、 c、 c、 d 和 e 亚基，它通过特定的旋转机制使质子跨膜 转运。而 少含有八种不同的亚基，分子量范围分别在 1370 间，有 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 和 H 亚基 (et 2003； et 2004； 2007； et 2008； et 2008；Ma et 2011)。 已知 亚复合体 5 种亚基 a、 c、 c、 c和 d 中，除了 d 亚基外，其余的亚基都镶嵌在质膜上。 d 亚基虽然是膜周蛋白，但可以与 密结合。亚基 c、 c和 c 形成 c 环型质子通道 (图 et 2008；et 2005)。 复合体中只有这 5 种 亚基都存在于细胞中时才能组装完整，缺失其中任何一种亚基都 使 a 亚基不稳定， 以锚定在 ，导致基和膜的结合受到抑制 (et 1997)。 兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 5 - 亚复合体 八种亚基 A、 B、 C、 D、 E、 F、 G 和 H 亚基都位于胞质中，其中 A 和 B 亚基都是三个拷贝，它们交替排列成柱状的六聚体(形成一个催化中心， D 和 F 亚基在催化中心 中心腔 中，形成而 E、 G、 四个亚基构成 它能将 的催化结构域 的 a 亚基 图 胞质中 复合体的八种亚基中任何一个亚基的缺失都可能使其余亚基不能在液泡膜上正常装配。同样 复合体装配不完全就难与 合体锚定 (et 2005； et 2009； Ma et 2011)。这就可以得出 14 种亚基中任何一种亚基的缺失，都可能致使 能完全装配，从而影响胞质 平衡、细胞许多重要生理活动 的进行 、各种离子和代谢物的转运等，进而影响细胞的正常发育。 图 酶的分子组装 (Ma et 2011) of 州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 6 - 已有研究得到 ， A 和 B 亚基上都存在一个 合区，同时 )元件 ，与结合 三磷酸盐 密切相联，致使 A 亚基的核酸结合位点有催化功能， B 亚基没有甘氨酸的 件 ，因此 B 亚基的核酸结合位点没有催化功能，它被认定具有调控功能。 A 亚基的氨基酸序列和其它的核酸结合蛋白具有很高的同源性， B 亚基也和核酸结合蛋白具有很高的同源性，因此可知 A 亚基和 B 亚基都能与核酸结合 (2007；et 2009； et 2006)。 图 亚基的结构及其 元件与 结构分析（ Ma et 2011） of 丝对真核细胞中的通讯起到重要作用，对细胞的胞质环流与运动、机械支持也是至关重要的。有研究发现植物、哺乳动物和酵母中的 基 元件 (图 能使 B 亚基结合 et 2005； Ma et 2011)。 C 亚基的和 B 亚基一样，也存 在一个类似 元件， 还有 另一个潜在的 合元件 ()，使 C 亚基至少存在两个微丝结合位点，分别在 et 2005)。亚基 C 也许还作为一个锚蛋白，可以调控 微丝骨架的相互联系。因此可知亚基 C 参与两个生理过程：调兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 7 - 控 性，结合微丝骨架。 以通过 B 和 C 亚基，直接与细胞骨架相互作用，动物和植物中都存在这种微丝结合特性 (Ma et 2011)。 在 D 和 F 亚基与 d 亚基一起构成了中心轴 (即转子 )， D 亚基中含有一些与 亚基相似的结构元件 ,可能使 D 亚基在 解和质子转运偶联过程中发挥着重要的作用 (et 1995)。当 F 亚基缺失时， 不能和膜正确结合，这就可得出 F 亚基可能有助于将 个亚复合体结构域联系起来。疏水性的 d 亚基是 复合体上唯一一个没有镶嵌进膜的亚基，折叠成 3 个含螺旋的结构域，形状类似倒圆锥状结构，可能在 分解 /装配中起到重要作用 (2007)。 复 合体上的 E、 G、 H 亚基和 复合体的 a 亚基构成外周轴 (即定子，它将 基 a 的 3系起来。其中， H 亚基具有 1 个 结构域和 2 个结构域，可能在 配中具有调控酶活性的作用。 a 亚基是一个膜蛋白，约 100小，由一个 其 、 E、 G、 H、 C 亚基相互作用或接近，而 膜并结合到 构上。另外， a 亚基的第 6 跨膜区上含有一个嵌 入精氨酸位点 (这对质子的跨膜转运非常重要 (et 2008； et 2008；Ma et 2011)。 c、 c 和 c 亚基是高度疏水亚基，它们构成了六聚体，形成一个质子通道，其中 c 和 c 亚基只有一个拷贝，而 c 亚基存在多个拷贝。 c 和 c 亚基含有 4个跨膜螺旋，而 c 亚基含有 5 个跨膜螺旋。这三个亚基对装配 一不可，每个亚基上都存在一个谷氨酸位点，是质子转运活性所必要的 (et 2003； Ma et 2011)。 泡 H+生理功能 液泡 H+在于原核和真核细胞中，包括哺乳动物如人、牛和鼠(et 2003a， Xu et 1999， 2002)，植物如拟南芥，真菌如酵母和细菌中 ( et 2003； J et 2009)。 一个特殊的细胞质子泵，可以作为 受器，它通过将质子泵到胞外 环境 或泵进胞内 的一些细胞器腔内来调节细胞内外的 ，使胞外或者细胞器腔内保持酸性环境，从而维持细胞内 相对稳定 (et 2006)。通常它介导细胞内膜的酸化以及多种重要的细胞过程，包括细胞的跨膜运输、 受体介导的内吞作用 、 胚胎的左右分布、激素原加工修饰、溶酶体水解、 蛋白质降解及 神经递质的释放 (2002； et 2006； Ma et 2011)。细胞内的酸性环境对许多细胞器 (如溶酶体、高尔基体、突触小体、吞噬小体和兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 8 - 植物体内的囊泡等 )是非常重要的，真核细胞中 过调节酸性环境来调控细胞内各种生理过程 (2002； 2007)。 最近一些研究表明， 细胞发育中起着重要的作用。例如，选择性基因失活使 合体的分解可导致小鼠在早期发育过程中致死(2002)。 不对称性分布在胚胎发育中起到关键性作用 (et 2006)。许多疾病都依赖于 能，如 感染流感和其他病毒 、 病毒性疾病 (et 2009)、 阿兹海默氏症 (et 1995)等。 而且， 参与细胞骨架动态装配的生理过程，其分布直接影响细胞骨架的构造。有研究发现亚基 B 和 C 可直接与基于微管和微丝的微丝骨架相互作用调控破骨细胞和闰细胞的特定功能 (et 2003)。 亚基的研究进展 要 负责 穿过质膜的质子 运输 和不同 细胞内细胞器的酸化 ，通过调控酸性环境来调节细胞的生理过程。在人类和 酵母细胞中，它的活性和其 B、C 亚基与 微丝骨架 的相互作用是必不可缺的。拟南芥 有三个 B 亚基，分别是 和 们基因冗余性高达 并且有两个 个潜在的肌动蛋白结合位点。这就表明 这些 因 可能在肌动蛋白细胞骨架的重构和植物细胞的发育 过程中 具有极其重要的功能 (Ma et 2012)。 006)等人研究发现，在葡萄糖应答胁迫时时， 糖激酶 (细胞核中特异性相互作用形成蛋白 复合体，协同作用来调节葡萄糖感受和信号传导通路，通过整合营养物质和激素信号来调控基因表达和植物生长。同时相比于拟南芥野生型， 1 亚基突变体 高浓度葡萄糖胁迫比较敏感，但是甘露醇处理时没有类似表型，说明突变体 不会因渗透压改变而 发生 反应。 最近研究发现， 过 B 亚基 点，可以与细胞微丝骨架直接 的 相互结合作用 (et 2003； et 2003, 2005)。 植物、哺乳类动物、酵母菌 中 亚基 守的 类似于 基序 (图 能通过这个序列 以剂量依赖性的方式 来结合 并引起 微丝 高级结构的形成。 这个 似的 序列对 微丝 结合活性非 常重要，当这 11 个氨基酸序列被敲除后 ， B 亚基的合活性受到抑制。 而且三个基因结合 能力是相似的 ，都是以念珠状的形态直接结合到 。 其中 拟南芥 保守的氨兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 9 - 基酸残基 为 保守的氨基酸残基为 Ma et 2011； Ma et 2012)。 在植物细胞中，肌动蛋白高级结构，如肌动蛋白丝束和肌动蛋白丝网，是稳定跨液泡索组织和维持整体细胞结构至关重要的。 有研究发现 以 抵消用，具有稳定肌动蛋白丝 和 成束作用 。 可以 结合到肌动蛋白丝、碍肌动蛋白的添加，具有封端活性 。 其中 端 是 剂量依赖性的方式， 而 不同浓度都有显著的封端作用 。但 微丝刺状末端的封端作用不受游离钙调节 (Ma et 2012)。 个基因在所有发育阶段的每个组织中都表达，但 在茎生叶、莲座叶和茎 (第二茎节 )中 表达水平低于其它 两个 ， 因芯片操作软件中表达 信号 也 显著 低于 然而在成熟花粉中， 表达的信号显著 高于 et 2007)。 能的相似性和差异性显示了它们在 拟南芥细胞中可能起到协同和特异的作用， 在生长、分化、发育 、 适应不断变化的环境条件和维持细胞形态中可能发挥不同的作用。 与逆境 胁迫 应答反应 逆境会限制和影响植物正常的生长发育，对植物造成严重伤害，其中低温、干旱、高盐、高温、水涝、过氧化物等都是非生物胁迫。由于植物在长期的进化过程中会受到非生物胁迫 ，使它们产生了一套自我保护机制来抵御 不良环境的影响。 植物 内膜 中存 在两 个活 跃的 质 子 泵： H+- 焦 磷酸酶(H+两者都能产生电势能， 并对继发性主动转运提供 一个质子动力势。 一个膜结合多亚基酶复合物，它广泛分布在真核和原核细胞中， 通常介导细胞内膜的酸化以及多种重要的细胞过程，细胞内的酸性环境对许多细胞器 和细胞内生理过程 是非常重要的 。 一个同型二聚体结构，由两个 71 80 基组成。它有以下三个功能： (1)在 使液泡膜产生 额外电势能； (2)在焦磷酸代谢中 起作 用； (3)在 体内 K+保持稳态过程中起作用。 H+ 通过 膜转移而产生的电化学梯度是液泡内离子和其他溶质积累的驱动力。这两个质子泵在植物响应环境改变 （ 如在盐胁迫 ） 中发挥重要作用 (et 2001)。 植物外界过剩的 仅影响体内 且干扰其它离子如K+/平衡，造成离子和电荷生理平衡的紊乱 (et 1995)。植物 中央兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 10 - 液泡在调节细胞质离子稳态过程中起重要作用 ， 从细胞质中有效排出多余钠离子和液泡钠离子积累是植 物适应盐胁迫时的主要机理。 对一些荒漠和抗旱植物如念珠藻 (et 2002)，盐地碱蓬 (et 2001)，盐角草 (et 1996)研究发现， 理可以在 平 和蛋白水平上激活 不同亚基。 例如 盐胁迫 应答过程中 ，冰叶日中花 (性增加 ， 相反的，第二液泡质子泵 活性降低。 液泡中钠离子的封存由液泡中的次要活性的 H+ 介导，这个过程由 et 2001)。 为一种植物激素，在植物生长发育过程中起重要作用，如促进果实与叶片脱落、器官衰老和气孔关闭 、 影响植物开花、调节种子和胚的发育等生理功能。已经研究得到 高植物对不同环境胁迫的适应性，例如在干旱胁迫、盐胁迫、低温胁迫中起重要作用。在干旱、 两者共同胁迫处理时，内源性 平就会增加，增加的这些 无胁迫植株中诱导产生许多干旱胁迫相关 的 反应 (王敏等 , 2011； et 1999)。 在耐盐植物冰叶日中花中也有研究表明， 激活是 的，外源 以激活成年植株中 转运活性。 导盐胁迫诱导冰叶日中花液泡中 H+ 性增加，从而使钠离子在液泡中封存。 理冰叶日中花导致 子转运活性都增强，两者混合处理时，对 性刺激具有累加效应。但是幼小植株用 理，不会诱导 性增加，而 理幼小植株时与处理成熟植 株时相同，都会诱导 性增加。这是因为 理幼苗和成熟植株时 H+ 性都会诱导增加，但 会在植物生长每个阶段都具有这个作用 ， 说明这种激活作用依赖于植物的发育阶段 (et 1999)。 还有研究知， 在一定程度诱导大麦中 合酶组分 A 亚基编码基因 转录表达，并且激活 H+ H+质子转运活性 (2006)，相似结果在黄瓜中也得到了证实 (et 2007)。 码拟南芥 合酶 C 亚基，对其缺失突变体 孔的研究发现，当 C 亚基功能缺失后，外源 氧化胁迫引起 荡和气孔关闭消失，但有趣的是，冷胁迫和 导的 荡和气孔关闭却完全正常(et 2000)。 甘露醇是一种六碳糖醇，广泛分布于自然界，很多生理生化研究发现有甘露醇代谢能力的植物对盐胁迫和渗透胁迫更具耐受性，另外它们还能更好地抵御外界病原菌的入侵，这很可能是因为甘露醇在维持细胞渗透势和氧化还原平衡上发挥了重要作用 (et 1996； et 1998)。尽管内源甘露醇对植物的兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 11 - 逆境适应很重要，外源过多的甘露醇却会造成渗透胁迫，影响植物的生长发育，有研究表明，跟 似，甘露醇引起的渗透胁迫也能够诱导大麦中 亚基基因 表达，并且激活 H+ H+质子转运活性 (2006)。 葡萄糖 (是许多类型细胞首选的碳源，它是细胞生长的决定因子 ，是最早发现也是最重要 的信号分子之一。在基因表达、细胞增殖和死亡、叶片生长和枯萎、种子的发育等过程中，葡萄糖分子具有关键性作用。葡萄糖的信号转导通路在酵母中被广泛研究，主要有 (径和 径 (2006)。并且研究发现，在葡萄糖的代谢过程中，细胞质 发生一些迅速且可逆的变化，作为细胞内 H+感受器，质子泵 与介导葡萄糖诱导的 (径 (et 2010)。有证据表明，当啤酒酵母 (乏葡萄糖超过 5 分钟，其 就会有 大约 75%解聚成胞质定位的 复合物和质膜定位的 复合物，当加入葡萄糖后，它们又会重新聚合成有功能的 整复合物，说明解聚完全可逆 (2000)。 006)等人还研究发现， 1 和 己糖激酶 ( 体，协同作用来调节葡萄糖感受和信号传导通路，通过整合营养物质和激素信号来调控基因表达和植物生长。同时相比于拟南芥野生型 ， 1 亚基突变体 高浓度葡萄糖胁迫比较敏感，但是甘露醇处理时没有 显著 表型 。 而且突变体 葡萄糖也很敏感，有矮小、分支等形态学差异， 是葡萄糖敏感型突变体。 总上所述， 植物、 酵母和一些哺乳动物体内的 参与逆境适应 、糖分代谢以及维持胞质环境稳定中发挥了重要作用，但是 胁迫应答过程中的 生理表型以及工作机理，目前还研究较少，所 以这篇论文以拟南芥 三个基因突变体为材料，通过体外的 露醇以及葡萄糖处理观察以及 亚基基因的表达模式观察来初步探讨植物体内生理功能，为之后的机理研究奠定基础。 研究的 主要内容 已知 亚基共有三个亚型 ，分别为 个亚基 基序，包含保守的甘氨酸 、缬氨酸 、 亮氨酸 、 天冬氨酸 、 苯丙氨酸残基和类似 L(K/R)的基序 。 可以通过 B 亚基 亚基 的 两个结构域上的微丝结合 位点来 与细胞兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 12 - 微丝骨架相互结合作用。通过体外实验证明 合、共定位于 有微丝延伸、稳定、成束、和封端等功能。 但是，目前有关 亚基的生理功能还不是很清楚。本研究对 B 基因的组织表达特异性 (色 )、 B 基因在转录水平上的特异性 (亚细胞定位进行了研究， 确定 了 三个亚基的组织定位和亚细胞定位 ；在胁迫条件下，以 三种基因的转基因植株和 突变体为实验材料，进行 露醇 和 葡萄糖处理，根据 相关株系的 生理 表型分析 结果 ，初步研究 亚基 的生理功能和 可能 参与 的应答胁迫反应；还构建了基因 3非翻译区的一系列 体，用 来进一步研究抗 性机理，为 研究 亚基 的功能及其参与 非生物胁迫应答反应提供一定的理论依据。 兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 13 - 第二章 材料与方法 验材料 物材料、载体、菌种、酶 野生型拟南芥 ( 态型 ( 因的 入株系种子购自美国拟南芥生物资源中心 ( 植物表达载体： 菌种：大肠杆菌 (杆菌 株，均为本实验室保存。 酶：反转录酶、 s 合酶、 限制性内切酶 、连接酶、 购自 司。 剂、药品 等药品购自 司； 质粒提取、胶回收试剂盒，植物组织总 取试剂盒从百泰克公司购买； 卡那霉素、氨苄青霉素、潮霉素、利福平、 购自 克等生物公司； 其他药品均为进口或国产分析纯。 实验过程中所需培养基、溶液如下： 养基： W/V)1%(W/V)1%(W/V)至121高压蒸汽灭菌 204保存。 养基： 1%(W/V)1%(W/V)W/V)至121高压蒸汽灭 菌 204保存。 体培养基 (1L)： 末 2%蔗糖、将 调至 入 1%琼脂粉， 121高压蒸汽灭菌 20平板。 植物基因组提取液 制 (100 2%20 100 色液 (10 3N)6， 4N)6 3100121002 10 末中加入 250L 解，再加入 50L)1加 全至 10 洗液：按照无水乙醇：冰乙酸 =3:1 的比例配制。 兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 14 - 质壁分离溶液： 20%蔗糖溶液 。 色液 ： 末用去 制为 10g/染色液。 器与设备 8 台式微量离心机 (温冷冻离心机 ( (凝胶成像系统 ( 电热恒温培养箱 (上海一恒 ) 光显微镜 (外可见分光光度计 (聚焦显微镜 验方法 将需要处理的植物组织放在一定量的已配制好的 色液 中 ， 37恒温培养箱中黑暗放置 3h，然后吸出染液，加入脱色液 (无水乙醇：冰乙酸 =3:1)适量，同样的条件下脱色 3h 以上，期间可换脱色液 1，以便脱色完全。最后 吸出脱色液， 在解剖 镜和显微镜下观察照相。 表达分析 实验 南芥不同组织总 提取 收集一定量的根、茎、叶、花、花苞组织，用天根高纯的总 速提取试剂盒，参照说明书的具体步骤来提取 析检测 (1)参照 说明书，用提取出的 转录 (2)以 为标定内参，用设计好的 反向引物进行 增，检测 因在不同组织中的表达量。 增体系 (25l)和 反应程序 如下： 模板 1l r (250 U) P/0M) 1l 0M) 1l 兰州大学硕士学位论文 拟南芥液泡 H+ 亚基功能初步研究 - 15 - 10 应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测 果电泳检测。 亚细胞水平上的表达定位实验 将 所需要的 过表达载体种子种在 板上，正常条件下生长 4d 以后 在普通 微镜下观察是否有荧光，若有就 用