【毕业学位论文】（Word原稿）人腺病毒南京、兰州、湖南地方株型别鉴定及Hexon全基因序列进化分析

兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 第一章 引言 腺病毒简介 腺病毒科（ 主要由五个属组成： 腺病毒（ ， 为 腺病毒科 的 哺乳动物腺病毒属（ 成 员之一 。 953 年，是 人从健康人萎缩的扁桃腺样组织中分离培养出来的， 1954 年 人 在患有急性呼吸道感染患者的咽喉 洗液中分离到同样的病毒，命名为人腺病毒 1,2。 引起人类呼吸道感染的主要病原体之一，尤其对免疫功能异常的人群和儿童易感 3,4。临床表现为广泛的疾病谱，包括上下呼吸道感染、病毒性胃肠炎、流行性或爆发性 角膜 结膜炎，还可引起一些罕见的并发症，如脑膜脑炎、急性出血性膀胱炎及肝炎。有报道研究表明 人 腺病毒感染与肥胖有关 5据研究报道显示：二十世纪八九十年代对全世界范围内引起人呼吸道感染性疾病的病毒进行分离鉴定，其中腺病毒占了 13%5,8迄今为止，已发现人腺病毒有 67 种血清型，分属于 7 个不同亚组 A G118,66。其中，与呼吸道疾病密切相关的是 B、 C 和 E 组，即是引起儿童急性呼吸道感染的重要病原之一，尤其是在婴幼儿和免疫缺陷者中可致严重的下呼吸道感染甚至死亡 17 为一种可导致广泛疾病谱的病毒在全世界范围内流行，可发生局部的暴发流行，因而受到世界各国的重视，如美国、韩国、日本都相继建立了连续多年的腺病毒监测网络 8,9,18。在中国，北京市、苏州市、南京市和武汉市等地也有对腺病毒的监测研究 21 形态与特征 包膜， 核衣壳呈二十面体立体对称，直径 90右，腺病毒基因组为线性双链 裹在由 252 个壳粒（ 成的病毒颗粒中27。腺病毒的 核 衣壳由 三个主要表面结构组成： 六邻体蛋白（ 纤维蛋白（ 五邻体蛋白（ 。 其中五邻体位于腺病毒二十面体的 12 个顶角，每个 面有一条长度 10纤维突起（ 即为纤维蛋白，构中的抗原决定簇决定了部分决定了病毒的种特异性和亚属特异性。另外 240 个非顶角壳粒即为六邻体（ 每个六邻体蛋白表面携带有主要的属和亚属以及次要的种特异性抗原决定簇 28,29。病毒基因组双链 占病毒兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 质量的 13%，与病毒多肽 V（ 368 个氨基酸）、 174 个氨基酸）和末端蛋白（ 671 个氨基酸）等蛋白质构成病毒核心，其中核心蛋白最主要的衣壳蛋白包裹着腺病毒基因组双链 图 1图 1 图 1形态结构图 1结构和成分 （ a）腺病毒二十面体的表面结构。（ b）腺病毒内部组成部分。 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 因组结构与编码蛋白概述 人腺病毒全基因组长约 32两端各有一个长约 100同的血清型其长度不均一）的反向末端重复区 ( 侧为病毒包装信号（ ），主要介导腺病毒基因组装配进入病毒衣壳。 列中第9核苷酸高度保守，一般在其内末端及相邻区域中有 列， 病毒的基因组含有两个相同的复制起始子，分别位于基因组结构两端的 30,31。根据腺病毒遗产物质 制的起始时间，基因组的转录 过程主要分为早期转录和晚期转录两个过程。 1B、 个非连续的转录单位 称为 早期转录基因 （ E） ， 主要调节病毒 转录和翻译， 晚期转录单位 （ L）包括 要与结构蛋白的装配和 复制有关 31。晚期转录起始于主要晚期启动子 (其功能为参与腺病毒基因组的调控。早期基因 于腺病毒基因组的左侧，表达蛋白与腺病毒感染引起细胞发生转化密切相关，主要功能是作为病毒基因 活动的起始因子，为病毒复制所必需，参与病毒基因和有关细胞基因的转录； 码 合蛋白，主要作用是参与及调节病毒遗传物质 复制； 编码一种糖蛋白，这种糖蛋白出现在宿主细胞表面 ，作为 病毒复制的非必需区 ， 核苷酸序列的的 缺 失或者丢失 ， 对 病毒 的增殖无影响， 能在 其敏感 细胞中增 殖 。早期转录基因表达产物与病毒逃避宿主免疫反应也密切相关； 因区 位于基因组的右侧，与病毒遗传物质 复制、转录子的拼接及晚期基因表达等活动都密切相关，且受 编码的 合蛋白的 调控 31而晚期 转录 基因（ L）主要编码病毒衣壳结构蛋白，为装配成熟的病毒颗粒所必需，所以晚期基因的结构相对比较稳定。晚期转录区域有一个共同的三联前导序列 (由 5端 200 个核苷酸构成。转录产物为长达约 29核苷酸转录物，通过各种方式的剪切加工，产生大量的 18 种不同的 些翻译成不同的病毒蛋白。 表 1腺病毒各个转录基因的功能 腺病毒基因 功能 早期转录基因（ E） 2， 3， 4 腺病毒基因的转录， 复制，宿主免疫抑制及抑制宿主细胞凋亡 延迟转录的早期转录基因： 装配腺病毒颗粒 晚期转录基因（ L） 2， 3， 4， 5 编码病毒毒的衣壳蛋白 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 图 1腺病毒的基因组模式图 因的结构和特点 人腺病毒编码的主要结构蛋白有六邻体蛋白（ 五邻体蛋白（ 纤维蛋白（ 87。研究已经证实 白主要携带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇以及次要特异性抗原决定簇 32,35 白由大约 900 多个氨基酸残基构成，富含羟基氨基酸，且氨基末端多乙酰化。脯氨酸残基在肽链中成对排列，中间相隔 1其他氨基酸残基，多肽两端极为保守的区域中 分布着57 个脯氨酸 。 白 的沉降系数常在 13s 左右， 含有 三个相同的亚基。各个不同的血清型腺病毒株之间的 基酸序列同源性高达 99%，变异区集中在胰蛋白酶敏感的位点附近，即第 140之间，这一区域可能含有型特异性抗原决定簇 31。 目前在蛋白结构数据库 三维结构图直接可以提供抗原表位的 信息，但是对于腺病毒各个型别的 33腺病毒六邻体多肽晶体结构的 X 衍射研究表明，其三维结构可分为致密的底座区，由一个五面体构成，而由底座区伸出的塔型区为三角形，具有 4 个环状结构 座区有 个区域，它们通过其内部环连在一起成为两条反向平行 折叠。塔型区的 曲成团，与另外两条 肽链的塔型区相互作用形成同源三聚体，结构最长，最复杂的 提供了六邻体与外界相互作用的结构域。 个高变区（ 除了 于 中以外，其余的 6 个高变区 位于 中。不同血清型 的 白 核苷酸序列及氨基酸的二级 结构研究发现， 构是由 保守区（ 高变区（ 成。 1 和 要集中在 个环状结构 36。 于蛋白质分子表面，与腺病毒的型特异性有关。 白能够刺激机体产生中和抗体以及组和型特异性抗体，是第一个被兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 结晶的动物蛋白。其多肽的第 281和第 441氨基酸构成了型特异性抗原决定簇。此外，利用单克隆抗体还发现在六邻体型特异性抗原与属特异性抗原之间存在有两组亚型特异性抗原决定簇（ 不同血清型别的分离培养株 白表面 数量不等， 组成形式包括顺 序（ 原和构象（ 原。紧接着又有研究发现：仅依靠六邻体基因高变区来确定型特异性可能会导致错失了其他重要的分离株的遗传差异，这些变异可能与宿主免疫反应和菌株毒力相关。比如，纤维蛋白具有细胞受体结合位点，而这些结合位点的改变可以改变的腺病毒的组织嗜性。同样，某些腺病毒早期蛋白编码基因可能会影响腺病毒细胞之间的传播 37因此，六邻体基因测序方法与其他分子分型方法值得进一步研究，以减少漏掉重要的重组腺病毒风险。 变区的结构 腺病毒的主要结构蛋白，含有大量的组和亚组特异性抗原表位，约2800苷酸，每个六邻体都是一个同源三聚体，由 900 多个氨基酸残基组成40,41。在 白 的三聚体表面，大部分组和亚组特异性的抗原决定簇存在于 3 个环上， 对应的氨基酸中，有 250 个变化的氨基酸残基，分为 7 个独特的高变区（ 37， 些腺病毒的 不同血清型之间长度是不相同的， 7 个 间的区域为保守性氨基酸序列，它们在很大程度上决定了不同血清型腺病毒的抗原特异性，其中 氨基酸残基序列变化最多的高变区。由下图我们可以清楚的看到 内部结构， 外部支撑区。 于 白的塔尖。所以我们不难得出： 3， 4， 5， 7都位于 白的表面，在决定组和亚组特异性抗原表位起至关重要的作用，因此对这 5 个 域的氨基酸序列进行重组和突变，可能逃避腺病毒对人体预存的免疫，从而对研究腺病毒疫苗和载体起到启发作用。 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 图 1腺病毒 因高变区（ 域的颜色：黄色， 色， 蓝色， 色， 色，色， 色， 病毒的疾病相关性 流行病学特点 腺病毒感染可累计呼吸道、消化道、泌尿系和眼部等组织，呼吸道疾病最常见，临床上多表现为普通感冒，喉咙痛（咽炎），支气管炎及肺炎等。相对罕见的可造成膀胱炎、胰腺疾病和中枢神经系统疾病 42在我国，腺病毒感染所致的婴幼儿肺炎曾 一度 非常 流行 ，导致儿童很高的致病率和死亡率， 后随着医疗水平的不断提高，腺病毒检测方法的改进，全国范围规范化监测网络的建立 21腺病毒感染的发病率和病死率均显著有所下降。然而近年来腺病毒感染又有增加的趋势，不仅是引起轻型的呼吸道感染，也引起一些重症感染和暴发流行。按其基因组结构、免疫学、生物学和生物化学的特性，目前 研究发现的血清型（候选血清型）已有 67 个 ，这些 血清型分为 7 个亚组，即 。其中最常见的 46,47， 40 型和 41 型 48呼吸道感染多以 3、 7、 11 型为主，主要的临床症状为高热、咳嗽、咽痛，少数会引起肺炎，可同时伴有咽结膜炎，尤其对婴幼儿 及免疫缺陷的患者 易感 30。 道感染多为 40、 41 型腺病毒，其临床表现为不同程度的腹泻，多为蛋花汤样，伴呕吐。 表 1不同亚组不同血清型人腺病毒感染相关疾病 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 腺病毒亚组 血清型 相关临床疾病 A 8,31 呼吸道、泌尿道及消化道疾病 B ,11,14,16,21,34,35,50,55 呼吸道、 眼部、泌尿道和消化道疾病 C ,5,6,57 呼吸道、泌尿道和消化道疾病 D 3,15,17,19,20,222,33,3621,53,54,56,58,65,67 眼部和消化道疾病 E 部和呼吸道疾病 F 1 消化道疾病 G 化道疾病 预防与控制 人 腺病毒感染主要在冬春季流行，容易在幼儿园、学校和新兵军营等封闭环境的人群暴发 感染 。腺病毒主要通过咳嗽、喷嚏 等呼吸道飞沫的呼吸道方式，密切接触眼部分泌物及肠道感染时的消化道三种方式传播 50其预防措施和其他呼吸道、消化道传染病预防类似，主要是勤洗手，多消毒，避免接触患者及其呼吸道飞沫。平常多饮水，多吃蔬菜和水果，注意锻炼身体；室内多通风，保持室内环境清洁；冬春流行季节尽量少去人员密集的公共场所，外出时戴口罩，避免接触病人，以防感染。此外加强游泳池和浴池水的消毒，可使水传播性结膜炎爆发的危险性降至最小，在做眼部检查时应严格无菌操作，对所用设备充分灭菌，也可控制流行性结膜炎的发生。如果发生急性发热、咽喉疼痛 和流行性角膜结膜炎等临床症状，应及早到医院观察，进行早隔离、早治疗。 目前对腺病毒感染的治疗仍无有效抗病毒药物。关于腺病毒疫苗， 1971 年曾使用过 口服的减毒活疫苗，随后的临床随机对照试验表明：这种疫苗能降低 50%吸系统疾病的发生 54,55，更能降低腺病毒相关呼吸道疾病的发病率 95%及时的阻断疾病的爆发 55,56。然而，在 1992 这种疫苗的唯一的制造商出于经济原因年停止生产。之后美国 4 个军事训练中心建立了以军队内部人员为基础的腺病毒监控，但由于疫苗的空白 ，腺病毒感染越来越广泛。直到 2011 年 3 月 16 号，美国食品和药物管理局（ 准使用由美国 药公司 验室生产的， 腺病毒疫苗，这种疫苗目前推荐只使用在军事人员（年龄 17），研究显示能有效降低腺病毒引起的急性呼吸道传染病的风险。但此种疫苗对一般感染人群未批准使用 57,59。兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 将来可能使用人二倍体细胞培养的减毒活疫苗来预防腺病毒感染。但诸多动物模型研究显示：腺病毒对动物具有致癌作用，人们对全病毒疫苗的作用与安全性存有疑虑。 分型及分型 方法 腺病毒在自然界分布非常广泛，迄今所知至少有 100 多个不同的血清型。人腺病毒 属于 腺病毒科的哺乳动物腺病毒属。到目前为止，根据分子生物学和免疫学方法分型，已发现的人类腺病毒有 60 多个不同的血清型别，分为 A、 B、 C、D、 E、 F、 G 七个亚组 11,13,15,16， 60，如下图所示，不同血清型具有不同的生物学特性，对人体不同的组织感染具有不同的倾向性，且 1/3 的血清型感染人类不同的组织能引起相应组织的病变。其中 于腺病毒的 A 组，多引起呼吸道、泌尿道、消化道 感染。有研究表明 持续隐性感染与腹部疾病的发病机制相关 55。 于腺病毒 B 组，主要导致呼吸道气管支气管炎、肺炎、咽结膜炎、尿道感染及胃肠道炎症 88,89。 尤其 婴幼儿呼吸道感染最常见的腺病毒血清型，能引起腺病毒的感染爆发，且病死率高达约 12% 16,46,54,61。 于 腺病毒 C 组，同腺病毒 A 组主要引起儿童呼吸道疾病，但有报道显示此组腺病毒导致的疾病临床症状相对较轻。人腺病毒 D 组的成员比较多，包括 3， 要易侵犯眼部和消化道及肾脏和尿道感染，眼部疾病相对比较常见，表现为流行性眼结膜炎 63,86,90。 新发现的两个血清型，均是从急性胃肠炎患儿粪便标本分离的，为 D 组其他血清型的重组株 11,66。 E 组腺病毒目前发现只有一个 要导致眼部和呼吸道病变，且好多研究发现它可造成新兵的 暴发 和流行感染 54,58。 于 F 组腺病毒，是引起儿童腹泻常见的主要病原体之一，仅次于轮状病毒 49,62。 G 组唯一的亚型，是 2007 年 人在一次爆发性胃肠炎患着恢复期的粪便标本中分离的，与 猴腺病毒属 1 型（ ）核苷酸序列同源性最高 67,68。 分型方法大体概括可分为两类：免疫学分型方法和分子生物学分型方法。前者主要包括对腺病毒外层蛋白衣壳上抗原和抗体的检测，即有经典的血凝抑制试验和特异性抗血清中和试验外，还有免疫荧光检测，酶联免疫吸附试验（ 64,71等。 研究实践已经证明 此种方法检测存在 一定的 缺陷，即 检测 所兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 需时间较长且灵敏度较低。分子生物学方法主要包括聚合酶链反应（ 多重 式 光定量 限制性片段多态 性（ 测，核酸杂交，原位杂交及时间分辨免疫荧光技术等 72， 这些方法使腺病毒的分型方法有了飞跃的改进，利用 技术特异性和灵敏度都大大提高。 图 人腺病毒分组分型 州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 细胞培养 目前对腺病毒 各方面的研究都进行得比较深入，其结构简单，在感染过程中可以产生大量的病毒 研究真核基因表达调控机制的良好模型，宿主范围广泛，感染率高，易于培养和纯化。腺病毒可在 肺上皮腺癌细胞 （ 宫颈癌上皮细胞（ 人胚肾上皮细胞（ 人喉癌上皮细胞（ 上皮细胞中增殖，并产生特征性的细胞病变效应 70,91 细胞变大，变圆，肿胀，团聚，有时可有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状，最后自细胞培养瓶壁脱落。 在 293T 细胞继代 ，出现细胞病变早且明显。 293T 细胞培养 36 小时后开始出现病变， 76 小时病变效应明显呈葡萄串状，而 胞和 胞出现 间相对较长，一般 48 小时之后。 上述敏感细胞的细胞质内合成病毒结构蛋白，在细胞核内组装成完整的病毒颗粒，当细胞完全破碎时，病毒粒子才能从细胞中释放出来。在提取病毒核酸之前，须用冻融裂解细胞或者超声波等方法将细胞震裂。 因特征研究的目的和意义 泛分布于世界各地，传播非常迅速，通常引起无临床症状的隐形感染，且伴随着其他 病毒和细菌的混合感染，对婴幼儿和免疫缺陷的患者易感。造成婴幼儿呼吸道感染最常见的病毒，造成了极大的疾病负担 70,73。清型别较多，近年来发现新的变异重组血清型越来越多，且重组变异的血清型毒力都远远强于原始株。六邻体 ( 重要的结构蛋白，能够刺激机体产生中和抗体，存在决定血清特异性的抗原决定簇，而这些抗原决定簇主要位于 构表面的 个环区。腺病毒中和抗体的产生主要针对其表面的高变区（ 31,37,70。近年来全 国各地均有 发 的报道，但关于 因的特点系统性的进化分析研究甚少。 主要的结构蛋白，其结构具有特异性，是编码 要中和抗原参与免疫反应的结构，由 发的中和抗体具有血清特异性。这种血清特异性可能是由 白的氨基酸序列决定的。明确腺病毒各血清型 基因特点，分析不同血清型 白是否发生变异，具有非常重要的意义。 对 白结构和功能深入的研究表明，决定血清特异性的抗原决定簇主要存在于 这三 个环上 31。 结构包括 个高变区，而 结构只有 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 这一高变区。诸多研究发现， 构存在抗原决定簇，且 99%的异性氨基酸残基都位于 论文就南京、湖南和兰州地区呼吸道标本进行人腺病毒检测，确定南京、湖南和兰州 流行病学特征；之后随机筛选各个血清型的阳性标本进行细胞分离培养，探究 型的 部核苷酸序列和氨基酸序列，确定南京、湖南和兰州地区人腺病毒 因的进化特点。 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 第二章 南京、兰州和湖南地区呼吸道感染腺病毒的检测 验材料 床标本及采集方法 南京和湖南 2010 年 8 月 7 月 、兰州 2009 年 12 月 11 因呼吸道感染在南京 市 儿童医院、兰州大学第一医院 儿科 和湖南省人民医院儿内科住院和门诊的儿童。对 3530 例住院和门诊患儿进行鼻咽抽吸 物的采集，用连接负压吸引器无菌吸痰管经鼻腔插入 7到咽部以下，负压吸取鼻咽部分泌物1入 2毒保存液（含有 1%的谷氨酰胺， 5%双抗），置于 低温冰箱保存至检测。 剂 毒 量提取试剂盒（德国 司） 合酶（大连 司） M 逆转录酶试剂盒（美国 司） 2.5 10 大连 司） L 100（大连 司） 胶回收试剂盒 国 司） 琼脂糖（ 美国 司） 国 司） 体（美国 司） 连 司） 大肠杆菌 受态细胞大连 司） 器和设备 电子天平（德国 司） 热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司） 热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司） 水平式琼脂糖凝胶电泳仪（北京六一仪器厂） （德国 司） 涡混合器（上海隆拓仪器设备有限公司） 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 养箱（日本 司） 倒置显微镜，显微镜摄像系统（日本 司） 二级生物安全柜（美国 司） 紫外照射仪（美国博朗特公司） 量加样枪 （德国 司） 国 司） 验方法 本的处理 将标本于 37 恒温水浴锅中充分溶解，高速旋涡振荡至水样，不粘稠，再于超净台中分装到 中，根据标本量的不同分装到不同数量的 中。利用高速低温离心机调至温度 4 ，转速 3700心 5 分钟。离心后取上清液，按 200l 分别分装至 中，剩余上清分装 1 200存 用。 本病毒核酸的提取 采用 剂盒提取 人 腺病毒 体方法如下： (1) 将 25白酶（或者蛋白酶 K）加入含有 200l 中（ 200l 标本从 冰箱取出后常温融化）； (2) 加入 200l L，高速旋涡振荡 15 秒； (3) 56 水浴 15 分钟，在恒温水浴箱内进行； (4) 水浴结束后， 5000 6000暂离心 5 6 秒 （将 沾于管口和管壁的液体离心至管底 ） ； (5) 加入 200l 无水乙醇（ 96% 100%），漩涡振荡 15 秒， 5000 6000 5 6 秒，将沾于管口和管壁的液体离心至管底； (6) 将步骤 (5)中液体轻柔地转移到离心柱中， 8000心 1 分钟，弃收集管内液体，换新的收集管； (7) 在离心柱中加入 500l 加过无水乙醇）， 8000 心 1分钟，弃收集管中废液，换新的收集管子； (8) 加入 500l 加过无水乙醇）， 14000 心 3 分钟，弃收集管中废液； (9) 将离心柱置于新的收集管中， 14000 离 1 分钟 ； 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 (10) 将离心柱置入干净的 P 管中，加入 50l E，室温静置 1分钟， 8000 心 1 分钟，洗脱核酸腺病毒核酸 (11) 将 30l 的 装成 5l 每管（ 保存于 ，以备后续试验使用。 要溶液的配制 (1) 养基：酵母提取物 5 g、 0 g，胰蛋白胨 10 g，加 到 容至 1000 进行高压蒸汽灭菌， 4 保存。 (2) 脂培养平板：取 1.0 g 琼脂粉加入到 100 B 培养 基中，高压蒸汽灭菌，待冷却至 37 左右时，加入浓度为 200mg/ 液，使终浓度为 100 g/培养基倒入平皿中，待其自然凝固后， 4 保存。 (3)1%琼脂糖凝胶：取琼脂糖粉 170冲液，在微波炉中火加热 3琼脂粉充分溶解，加 5酸染料 (4)50 泳缓冲液：将 242入到 950去离子水中，待充分溶解后，加入 醋酸和 加水定容至1000 腺病毒 增鉴定 对 3530 份呼吸道标本腺病毒的核酸 行了 增鉴定 46,77,81。 表 2人腺病毒 增引物 引物名称 核酸序列 目的片段的长度（ 88 88 21 21 第一轮反应总体系： 25l 10 2l 0M) 1l 0M) 1l 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 合酶 板 5l 二轮反应总体系： 25l 10 2l 0M) 1l 0M) 1l 合酶 一轮的 物 1l 轮反应条件相同： 94 54 30s 52 30s 352 22 5预变性温度 94 ， 3性 94 ， 30s；退火温度 52 ， 30s；延伸温度 72 ， 2火温度可以根据适当调整，是扩增产物浓度提高，电泳鉴定条带更亮。两轮从变性到延伸循环 35 个循环。 增产物的胶回收及 T 载体的连接 取 5物与 1l6合物在含 2% 1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测， 160V 电泳 20 分钟，电泳鉴定阳性标本直接送测序。弱阳性标本再用原来的 增条件但体系加倍即总体系量（ 50增，扩增产物再次使用 1%的琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯光下切下含有目的条带的凝胶，随后利用德国 司的胶回收试剂盒（ 行胶回收。具体操作如下： (1) 将 10要回收的 物混合，加入 脂糖凝胶模板，同时加入 100流电压 120V，电泳约 20 分钟； (2) 在长波紫外灯光下，切下目的条带放入 中； (3) 在 中加入产物凝胶 3 倍重量的 分震荡后置于 50 恒温水浴锅中水浴 10凝胶可以完全溶解（期间每 2荡一次）； 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 (4) 如果 目的条带 4，加入 100l 异丙醇混匀； (5) 将上述 中液体转移至离心柱中， 14000心 1 分钟，弃收集管中滤液（如果凝胶溶液体积大于 650l，可重复进行此步骤）； (6) 加入 过无水乙醇） 750l，室温下静置 5 分钟； (7) 14000心 1 分钟，弃收集管中滤液； (8) 空离 75 秒，将离心柱移到干净 中，加入 30置 2 分钟， 14000心 1脱胶回收产物。将回收好的 入 冰箱保存，备用。 胶回收产物通过 接酶连接到 体， 4 过夜，连接的具体操作如下： (1) 在 中加入 2连接缓冲液 体 回收产 物 匀； (2) 短暂离心后封口胶封口， 4 过夜。 接产物的转化 将连接产物转化至大肠杆菌 受态细胞（大连 司），挑 3液送测序。转化具体操作过程如下： (1) 分装 25 30受态细胞于 中，加入 5l 连接 产物，混匀； (2) 冰中放置 30 分钟； (3) 42 水浴 90 秒（时间应严格 90s），快速转至冰上； (4) 冰浴 2 分钟； (5) 加入 100l 无氨苄青霉素的 养基； (6) 在摇箱中 37 150荡 1 小时，将菌液均匀涂布于含 500ug/苄青霉 素的 板（已均匀涂布 1650mg/ 8200mg/上，置于 37 培养箱中 14 16 小时。 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 克隆及摇菌 在已出现蓝白斑的平板上选取生长良好的白色单菌落，接种于 2氨苄青霉素（ 100ug/液体 养基中， 37 剧烈震荡 12 小时。取 300 500 图 2通 序峰图 计学方法 采用 行数据统计，计量资料采用均数 标准差表示，两组之间率的差别使用 2 检验或者 切概率法 ，两组之间均数的比较或几何均数 549 例患儿门诊患儿164 例，住院患儿 385 例，门诊患儿和住院患儿人腺病毒检出率差异有统计学意义（ 的患儿人腺病毒检出率较低。纵向看下面三个图均可显示 12通过统计学方法分别比较南京、兰州和湖 南 3 岁患儿与 3 岁的患儿，人腺病毒检出率差异性无统计学意义（ P 图 2南京 2010人腺病毒阳性患儿年龄分布 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 图 2南 2010人腺病毒阳性患儿年龄分布 图 2州 2009人腺病毒阳性患儿年龄分布 京 、 湖南 和 兰州 腺病毒阳性患儿的季节分布 将 549 份人腺病毒检测检出的阳性数、标本总数及检出率按三个地区分别进行统计，南京 4 月份和 12 月份检出率出现两个小高峰， 兰州 4 月份出现一个高峰，而湖南则是 5 月和 7 月出现 人 腺病毒感染高 峰， 统计学 分析南京、湖南和兰州三个地区人腺病毒感染无明显季节性。 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 图 2南京 2010人腺病毒阳性患儿季节分布 图 2南 2010人腺病毒阳性患儿季节分布 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 图 2兰州 2009人腺病毒阳性患儿季节分布 京、 湖南和兰州 地区腺病毒阳性的分型结果 南京、 湖南 和 兰州 性标本的分型结果显示 主要流行株，分别占各地区检出率的 62%， 80%， 81%。 属于人腺病毒 B 组， B 组少见的血清型 别在湖南和南京也有检出。其他血清型 也在三个地区不同程度检出，但检出率相对较低。 图 2南京腺病毒阳性标本分型结果 兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 图 2湖南腺病毒阳性标本分型结果 图 2兰州腺病毒阳性标本分型结果 论 急性呼吸道感染（ 引起全世界儿童最常见的疾病，是导致小于 5 岁儿童发病和死亡的主要原因之一。 主要病因即为病毒，主要包括呼吸道合胞病毒（ 人腺病毒（ 鼻病毒（ 流感病毒（ 副流感病毒（ 人偏肺病毒（ 都是最主要的引起呼吸道症状的病毒74。以往的流行病学资料表明，人腺病毒多感染 5 岁以下儿童，尤其 2 岁以内的儿童发 病率最高 78,82。 关呼吸道感染非常常见，大约 5%童上兰州大学硕士学位论文 人腺病毒南京、兰州、湖南 地方株型别鉴定及 基因序列进化 分析 呼吸道感染和 5%下呼吸道感染是由然腺病毒感染导致的 78。人腺病毒引起的急性呼吸道感染可全年散发，大多数研究报道无明显的季节性 3,6,8，也有报道冬春季多发 21,24。作为