【毕业学位论文】（Word原稿）乙醇对家兔心脏骤停后综合征脑保护的实验研究

兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 1 第一章 前 言 众所周知，随着人民生活水平的提高，心脑血管疾病已成为威胁人类健康的主要杀手。已有研究显示：美国每年有 40 万人发生心脏性猝死，中国不完整的资料显示每年大约有 人发生猝死 1, 2。尽管临床医师已做出不懈努力 ,使现场复苏成功率达 40%，但心肺复苏（ 者的出院存活率依然很低。国外报道住院患者 院存活率为 22%，国内仅为 其原因包括（ 1）复苏后心功能不全：约占 1/3，是最初 功后院内死亡的首要原因。绝大多数患者在 72 小时内死亡 。 死亡原因 主要是心力衰竭和或心室颤动。（ 2）中枢神经系统衰竭：是最初 功后院内死亡的另一重要原因。约有 1/3 患者尽管自主循环恢复、器官功能良好，但却因脑功能障碍而致复苏失败。（ 3）脓毒症、多器官功能不全综合症（ 约占 1/3，是复苏成功后期死亡的主要原因。以上统称心脏骤停后综合征 3。因此，目前 究重点已从注重复苏成功率转向注重复苏后远期存活和生存质量 既转向心脏骤停后综合征。复苏的最终目的是患者智能的恢复，而不是造就植物人。因此，本课题主要针对复苏后的脑功能障碍进行研究。 早在上世纪 60 年代 临床医生就已经注意到心脏骤停后脑功能恢复的重要性，认为其与恢复心脏自主循环同等重要，并为此进行了一系列研究和尝试，但基于当时认识水平和医学技术的局限性，导致绝大多数研究不尽人意，脑复苏研究基本处于停滞阶段。直至 2002 年新英格兰医学杂志同时发表了 2 篇具有里程碑意义的临床研究，这两篇前瞻性、随机对照试验均证实亚低温疗法对心脏骤停所致脑损伤具有保护作用，从而使亚低温治疗重新成为众多学者关注的焦点。新近， 4首次报道在创伤性颅脑损伤患者中， 在一定范围内， 血清乙醇浓度 与 患者死亡 率 相关 。血清乙醇浓度 230mg/患者表现出较好的生存率。 5证明：在沙鼠全脑缺血的模型中，乙醇（ /公斤）可以减少神经细胞的死亡。我国王飞等 6人已经证明乙醇对于急 性缺血性 大鼠具有脑保护效应。 心脏骤停后综合征 (指心脏骤停后全身缺血以及发生于自主循环恢兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 2 复后的再灌注反应，导致了复杂的病理生理学过程，包括心脏骤停后脑损伤，心肌功能异常和全身缺血再灌注反应等病理生理学改变。目前心脏骤停的生存率仍然很低，仅约 1 3 可以生存出院 7。 绝大多数心 脏性猝死发生在有器质性心脏病患者。在西方国家，心脏性猝死中约 80%由冠心病及其他并发症引起，而这些冠心病患者中约 75%有心肌梗死病史。心肌梗死后左室射血分数降低是心脏性猝死的主要预测因素；频发性与复杂性室性期前收缩的存在，亦可预示心肌梗死存活者发生猝死的危险。各种心肌病引起的心脏性猝死约占 5%是冠心病易患年龄前（ 35岁 )心脏性猝死的主要原因。如肥厚梗阻性心肌病、致心律失常型右室心肌病。此外还有离子通道病，如长 8。 心脏骤停后 即刻期，是自主循环恢复后的 20 期受治疗干预影响很大。心脏骤停后早期，是自主循环恢复后 20期的干预可以改善预后。心脏骤停后中期是在自主循环恢复后 62时病理生理损伤仍然很严重，在 脏骤停后恢复期，是自主循环恢复的 3 此期进行预后判定更为可靠 6。 心脏骤停后综合征的病理生理学 心脏骤停后心肌功能异常：约占 1/3，是最初 大多数患者在 72小时内死亡 ,死亡原因主要是 心力衰竭和 /或心室颤动。缺血再灌注损伤：自主循环恢复后，缺血再灌注激活了免疫反应和凝血机制，引起全身炎症反应综合征，导致凝血机制活化，而内源性纤溶活性不足，从而引起了广泛的微血管血栓形成 7。 2 缺氧的直接后果 脑缺氧 20秒后，神经元的氧储存可被耗尽，缺氧时间在 5分钟以上，神经元的葡萄糖和 而导致细胞膜功能失调和去极化，进一步引发钙离子内流、乳酸性酸中毒、谷氨酸盐释放、游离脂肪酸和兴奋性氨基酸产生。最终使细胞水肿 ,细胞膜破裂 ,并激 活 赖的缺血损伤瀑布效应 , 导致神经元死亡。兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 3 大脑中有一些区域对缺血缺氧的耐受性特别脆弱比如：海马区、新大脑皮质、小脑。有研究报道，神经元的损伤有以下途径引发：自由基触发的损伤级联反应，引发再氧化诱导的化学反应。这种化学反应在选择性的脆弱神经元上显示长期的刺激毒性，从而导致长期的钙负荷、持续的脂膜去极化和原发性坏死及细胞凋亡9, 10。 自主 循环 恢复 后，血管持续扩张，血容量减少，血液浓缩、淤滞，血液粘滞度升高，形成微血栓。再灌注开始之后，部分脑血管平滑肌痉挛，加重脑组织的低灌注 状态；另一方面细胞膜磷脂酶 放花生四烯酸，衍化为血栓素 白三烯及过氧化物等多种细胞毒性物质。这些细胞毒性物质显著促进血管平滑肌收缩和血小板凝集作用，进一步加重组织缺血缺氧状态。从另一个角度来看，脑缺血再灌注时 ,全身炎症反应活跃，大量的炎性细胞因子 ( 达增多 ,使趋化因子释放、粘附分子 ( 上调。白细胞与血管内皮细胞相互作用，结果白细胞粘附于血管内皮细胞阻塞微血管引发 “无复流 ”现象。白 细胞在血管内聚集释放氧自由基、蛋白水解酶及细胞激动素等。这些有害物质直接损伤内皮细胞导致血脑屏障破坏 ,最终导致神经元的损伤 10。 目前，国际上将低温分为轻度 (33)、中度 (28)、深度 (17)和超深度 ( )，其中轻度和中度低温 (28 )统称为亚低温 ( (1) 亚低温治疗 亚低温治疗 机制：降低组织代谢率 ,维持氧供需平衡 , 抑制兴奋性氨基酸的释放 , 防止血 减轻白细胞在损 伤区域的黏附等。 亚低温可促进代谢率的恢复，能较好地保护高能磷酸盐，减少有毒物质的蓄积。减轻多种原因引起的脑水肿，降低颅内压，改善神经功能。亚低温治疗的具体实施：有学者认为，如果低温治疗在脑缺血后 6小时内开始，神经细胞损伤可以降低 50%。如果 12小时内开始低温治疗也能明显降低神经细胞损伤。如果治疗时间窗超过 24 36小时，神经细胞保护作用最低。因此亚低温治疗时间窗越早越好，越快越好。体温降至35 是关键性温度点， 33 脑保护最好 11, 12。 (2) 深低温 所谓深低温是指：将脑组织温度快速降至超深低温 （ 16 ）水平而将全身兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 4 体温仍维持在正常体温的方法。这种方法不但可以取得良好的脑保护作用，而且可避免在复温过程中所造成的心肺损害。这种方法可以有效地阻断严重脑缺血性疾病时神经细胞的病理损害过程，大脑温度下降得越低，神经细胞能量代谢和耗氧量越少，脑细胞保护效果越好。目前国内外学者推荐头部深低温治疗时间窗是脑缺氧缺血最初的 10 分钟，但深低温脑保护的机制尚不清楚 13。 脑缺血损伤导致神经元末端释放谷氨酸盐 , 后者刺激 基 - 门冬氨酸 (受体 , 引起兴 奋性毒性作用 , 激活 依赖的缺血损伤瀑布效应 , 导致神经元死亡。目前的研究针对钠钙交换蛋白 (家族的 3 种基因表达产物 (进行。针对每一种 作用进行研究将有助于设计合理的药理学策略以减低神经兴奋性毒性。多项降低神经兴奋性的药理研究已进入临床实验 , 如谷氨酸盐释放抑制剂、 体拮抗剂、钙离子通道阻滞剂及氧自由基清除剂等。但目前仍未取得令人满意的结果 14。 在大鼠脑缺血再灌注损伤模型中 , 使用蛋白酶抑制剂 制 B 活性 , 可以降低 、 、 和 的表达水平 , 减少局部缺血脑组织内中性粒细胞和巨噬细胞的浸润 , 减少脑组织缺血坏死。在实验研究中，特异性抑制黏附分子或细胞活素表达的治疗方法也显示出较好的效果。如用反义寡核苷酸抑制 或用拮抗剂 择性抑制 能缩小梗死灶 , 降低神经元损害。但这种药物通常需要很长时间才能起效。降低炎症反应的同时也降低了神经营养因子的表达 , 这可能对脑损伤的修复有害。因此 , 如何有 效地发挥抗炎反应的神经保护作用 , 仍需进一步研究 2。 目前尚在实验中，丝裂原活化蛋白激酶 (途径被认为可通过 基末端激酶 ( 和 路对神经凋亡进行调节。动物实验发现 : 制剂可减轻神经元凋亡 , 一种新的 制剂 , 在脑缺血模型中 ,可显著降低核底物 活性 , 并使非核因子 活 , 因而可能是一种治疗脑缺血的有效方法 2。 目前已上市的抗氧化剂： 进入临床研究阶段的抗氧化剂 : 305) 、 59、 8075 等。其中 大鼠局部脑缺血模型实验中 , 能明显预防脑缺血和缺血后脑膜炎 , 减少脑梗死面积。若在发病 24 h 及 72 h 内用药 , 总有效率分别为 73. 8%和 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 5 与安慰剂组比较 , 差异有统计学意义 2。 随着分子生物学技术的进步，基因治疗在缺血性脑损伤中逐渐成为近年研究的热点 ，其中载体是基因治疗最主要的制约因素，理想的载体应该是可以将基因转移到特定的细胞或组织中，不引起免疫和炎症反应及潜在的基因突变，并且基因的表达也能得到有效的控制。重组腺相关病毒 ( 体是安全性最好的病毒载体系统 , 在动物中枢神经系统中已进行了有效转导，通过基因治疗可调节兴奋性毒性作用、减轻钙超载、降低炎症反应和增加 凋亡基因及血管活性因子的表达 , 从而发挥神经元保护作用。15线栓法制作大鼠局灶性脑缺 血再灌注模型 ,在缺血前 4,结果表明 ,缺血后 动物的神经功能也相应得到了一定程度的恢复。 16在大鼠脑缺血后向缺血皮质内注射 果表明 ,缺血后3一步的研究发现 ,高表达的 管基因治疗技术在不断发展 ,目前仍存在许多障碍 , 如研究更安全、高效的载体 , 提高载体转染率 , 对于脑缺血要尽早进行转染 , 以及进一步了解哪一种基因更适合脑缺血的基因治疗等。 白简介 白分子量 21物半衰期 132 常成人血清中浓度低于 0. 2g/L,通常难以测定。 1965 年由 7 首次报道从牛脑中分离出来的一种酸性钙结合蛋白 , 主要存在于中枢神经系统各部的星形胶质细胞的胞液中 , 因其可100 %溶解于 为 7 的饱和硫酸铵溶液里 , 故命名为 白。 白不含任何糖类、脂类和核酸成分 ,由同分异构的两个亚单位（ ， ）组成的同型二聚体或异型二聚体。细胞内绝大多数 白分子以同型二聚体的形式存在。此外还能形成 100100型二聚体， 100聚体以及 100聚体等，其聚合作用主要依赖疏水作用力。有 2 个 亚基， 含有 1个 亚基， 2个 亚基组成。不同的 白含有类似的氨基酸结构域，在氨基端和羧基端均含有疏水区，在每个亚基的羧基端均含有 1个 与钙离子结合 后， 露出其与靶蛋白的结合位点，进而通过与相应的靶蛋白作兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 6 用发挥其生物学效应。 白的功能： 大部分作为钙受体结合蛋白存在于细胞浆中而发挥作用，在细胞结构形成、生长、能量代谢及细胞内细胞间信号传导方面发挥一定的作用，在中枢神经系统主要影响神经胶质细胞的生长繁殖、分化、维持钙稳态，并对学习记忆等发挥一定作用。其他功能还有： 调节细胞内的一系列过程 (细胞间交流、细胞结构、细胞生长、能量代谢、 收缩和细胞内的信号传递 )； 促进轴突生长，胶质细胞的增生，神经元的分化和钙离子内环境的稳定； 阿尔采木病和艾滋病的相关因子 18。 白的检测方法 ： (1) 免疫光学测定法 : 19人设计了此法，可直接用全血检测 时不超过 20辨率可达 g/L。 (2) 免疫放射测定法：该方法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，而且可对抗原和半抗原测定以及仪器设备条件要求不高等优点。 (3) 荧光免疫测定法：此法灵敏度可达 g/L,重复性好，可自动化，但需有专门的荧光设备，因此在临床上不易普及。 (4) 酶 联免疫吸附法：它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。具有快速、灵敏度及特异性高的优点，分辨率达 g/L,在临床上具有较大的应用价值。 白在大脑缺氧后的变化情况 ： 缺血性脑损伤后 20清 白即可达到峰值。这一迅速的变化是因为低氧使胶质细胞的细胞膜完整性遭到破坏，释放 白进入脑脊液，同时缺氧还造成 血脑屏障受损，而血脑屏障通透性增高使 清中 白浓度迅速升高。在缺氧时间较短的情况下，血清白一般在 24心搏骤停的患者 12h 时血清 仍高于正常，这可能由于应用肾上腺素导致低氧性脑损伤所致，一般在第 2也可以表现为持续维持较高水平，甚至进一步升高，提示可能发生严重的脑损伤。 h 个月意识未恢复的阳性预测值为 94. 1%、阴性预测值 72. 7% , 12 00%和 81. 8%， 24 7%和 66% ,48 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 7 90%和 80% , 72 00%和 90%20。 综上所述，对于复苏后脑保护研究至今尚无令人满意的治疗方法，尽管长期以来，我们一直关注乙醇滥用所致的不良影响，但是在过去几十年仍发表了许多研究证明其对人体有益的影响。 （ 1） 4从 2000 年 1 月至 2005 年 12 月，在洛杉矶加州大学外科重症监护病房，共收集了 482 例重型颅脑损伤患者。入院后行血清乙醇 含量测试，根据血清水平，将患者分为乙醇阳性组及乙醇阴性组。使用 归分析，判断乙醇含量与患者生存率的关系。结果发现，在 5 年期间， 482 例重型颅脑损伤患者，乙醇阳性组占 37%，乙醇阴性组为 63%。乙醇阳性组中男性的比例较高，为 91%，穿透伤的比例较低 9%，损伤严重度评分较低，总体死亡率显著降低。幸存者血清乙醇的平均水平显著高于死亡者。结论：在一定范围内，血清乙醇浓度与重型颅脑损伤患者生存率独立相关。也就是说血清乙醇浓度小于 230mg/现出较好的生存率，相反，大于 230mg/现出较差的 生存率。 （ 2） 人 21进行乙醇毒性测试。他们将 鼠分为 3 组，分别是对照组， 2g/醇组， 3g/醇组。建立单侧大脑中动脉阻塞动物模型，在动物模型建立前 1 小时，给予 2g/醇， 3g/醇腹腔注射。平均脑组织含水量分别是：缺血核心区， 。中间区： 外带是：中间区含水量， 3g/显大于对照组和 2g/因素方差分析显示：在减轻脑组织含水量方面，有明显的量效关系。低剂量乙醇趋向减轻脑水肿 ，高剂量乙醇增加脑水肿。 （ 3） 22进行了一项研究，比较乙醇及咖啡因单独应用及两者联合，对 局 灶 性脑梗死体积的影响。共分六个治疗组， 口服生理盐水组， 口服咖啡因（ 10mg/ 口服乙醇（ ， 口服乙醇加咖啡因， 静脉注射生理盐水 ， 静脉注射乙醇加咖啡因 ， 造模前，乙醇加咖啡因口服三周。左侧大脑中动脉阻塞后 3 小时，再灌注 24 小时，比较脑梗死体积。结果发现：单独口服乙醇（ 疗组明显加重脑梗死体积。 （ 4）王飞等 6报道乙醇对于脑缺血性卒中有保护 效应。他们将 鼠分为一个假手术组和四个卒中组。用线拴法制作脑梗死模型，在大脑中动脉闭塞 2 小时， 3 小时， 4 小时，分别给予不同剂量乙醇（ 再灌注 48 小时后。处死动物行脑组织 色，比较脑梗死体积变化及 表达。结果发现 醇在大脑中动脉阻塞 2 小时给予，可以减少梗死体积和兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 8 行为障碍。与溶栓剂合用，不增加脑出血发生率。 基于此，本课题假设：乙醇可能对心脏骤停后综合征大脑具有脑保护作用。 综上所述， 21已经证实，低剂量的乙醇组（ 2g/显减少缺血核心区含水量， 3g/剂量较大，增加了脑水肿和乙醇血清浓度（ 230mg/我国王飞等 23人也已证实，乙醇剂量为 生的血药浓度（ 89mg/合法律所界定的范围（ 200mg/适合神经保护作用的研究。在其他研究中 22，低剂量乙醇（ 产生的血药浓度 46mg/有表现出卒中后的脑保护作用。因此，本实验采用乙醇剂量为 课题组拟通过建立家兔心脏骤停模型，阐明乙醇 对复苏后大脑是否具有脑保护作用，并明确乙醇脑保护作用的最佳剂量 。如能取得预期效果，将有望为下一步临床脑复苏研究提供实验依据。 (1) 脑坏死体积的比较 (2) 在复苏成功后 2h、 8h、 12 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 9 第二章 研究方法与实验过程 本次试验选用 40只成年健康家兔，雌雄不拘，体重 兰州大学基础医学院动物实验中 心 提供。家兔喂养的环境温度为 255 ，相对湿度为605%，实验前 12小 时 禁食、不禁水。 实验前将家兔称重后，采用随机数字表 法 分入以下 5组： 醇组， 照组， 假手术组。按家兔体重分别计算出不同 的乙醇剂量 并用生理盐水 稀释至 10苏成功后即刻将乙醇通过颈内静脉注入家兔体内。每天手术时间固定。 家兔仰卧位固定，通过兔耳缘静脉 25%乌拉坦（ 4ml/慢注射，术中如果需要可再次追加以维持麻醉，心电监护标准肢体 导联监测心电图。无菌操作条件下沿颈部 正中线作一 离皮下组织、肌肉，暴露气管，在喉以下 1入 线固定，家兔自由呼吸室内空气。分离右颈动脉，分离一侧股动脉插入导管测定平均动脉压（ 采集血液标本供生化检测，所有压力导管预充 通过压力传感器与多导联生物功能实验记录仪连接并记录数据。用套管针作颈内静脉穿刺以备给药。必要时生理盐水 10维持家兔血压、心率稳定 。 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 10 A B. 图 1 准 导联）， 压力变化波形 苏动物模型及各组干预措施 采用体外电击诱发室颤动物模型，在家兔胸壁心尖搏动点和右锁骨下分别插入电极，建立与直流电变压器相连的环路，接通 500s，必要时可重复，直至 0 A B 图 2 准 导联）， 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 11 室颤持续 3经过培训的专人行徒手胸外按压（ 200次 /分，按压：通气 =15:2，按压与减压间期相等，深度为兔胸廓前后径的 1 3），同时给予机械通气（ 00%，潮气量： 15ml/胸外按压 2次 30后持续胸外按压 2仍为室颤再以同样能量电除颤，如此反复 3次为一周期。 15复苏未成功的动物于第二轮除颤前重新开始胸外按压并持续 2主循环恢复标准：恢复室上性心律、 60主循环 恢 复后，若自主呼吸恢复，可停止机械通气，自由呼吸室内空气。整个实验过程按照 24 A. B 图 3 A 为除颤成功后心电图出现正常心电图表现（标准 导联）， B 为除颤成功后股动脉内压变化波形。 按家兔体重分别计算出不同的乙醇剂量 并 稀释至 10自主循环恢复后即刻， 将乙醇通过颈内静脉 快速滴 注入家兔体内 。 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 12 (1) 脑坏死体积的比较：动物存活 12死动物，剪开皮肤暴露头及颈段，分离除去后颈部肌肉，用骨钳仔细剔除颅骨，剥离硬脑膜，从延髓开始慢慢分离颅底组织取出大脑置于脑槽内。以视神经交叉为标志，将大脑切为 2度的六片冠状脑片，去掉多余部分，将 六片脑片置于 1% 765）溶液中恒温 37 染色 20色完成后，将冠状脑切片顺序排列，数码相机拍照，输入图像分析系统软件处理（ (2) 在复苏成功后 2h、 8h、 12h 抽血检测 白 ( ) 仪器 厂家 物机能实验系统 成都泰盟科技有限公司，中国 生理压力传感器 国北京航天医学工程研究所，中国 物呼吸机 成都泰盟科技有限公司，中国 高速台式离心机 海安亭科学仪器厂，中国 交流电电压转换器 上海变压器厂，中国 物心脏导管 成都泰盟科技有限公司，中国 便携式心脏除颤仪 本光电工业株式会社，日本 低温冰箱 基础医学院机能实验室提供 自制致颤仪 医用氧气瓶 基础医学院机能实验室提供 数码照相计算机图像分析系统 实验室 兰州大学机能实验室提供 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 13 应用图像分析系统软件处理并统计，采用 28推荐的间接法计算脑坏死体积。 白 ( )检测方法和原理 (1） 白检测采用酶联免疫吸附法，具体为双抗体夹心法。 (2）双抗体夹心法测兔血清 白浓度原理： 试剂 厂家 盐酸肾上腺素注射液 天津药业集团新郑股份有限公司，规格 克/1 毫升，批号 1012302 765,5 100乙醇 上海南翔试剂有限公司 兔子 白 剂盒 上海雅吉生物科技发展公司 25%乌拉坦注射液 兰州大学机能实验室提供 10%甲醛溶液 天津市致远化学试剂有限公司，批号 20100928 肝素钠注射液 天津生物化学制药有限公司，规格 12500U/2号 20111002 化钠注射液，医用消毒碘伏、乙醇等 兰州大学第二医院内科 州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 14 用抗兔 抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 单抗结合，加入生物素化的抗兔 成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的链 酶亲和素与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450测 ， 度与 成正比，可通过标准曲线求出标本 (3）试剂盒组成 酶标板（ 96 孔 10标本稀释液（ 12准品（ 40 2 瓶 第一抗体工作液（ 12标抗体工作液（ 120浓缩洗涤液（ 50物工作液（ 124） 操作步骤： 加样：分别设空白孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100l，余孔加待测样品 100l，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜， 37 反应 120 分钟。 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加辣根过氧化物酶标记抗小鼠 作液100l(取 1l 生物素标记抗体加 99l 生物素标记抗体稀 释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制 )， 37 ， 60 分钟。 温育 60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1钟， 350l/每孔，甩干。 依序每孔加底物溶液 90l， 37 避光显色 (30 分钟内，此时肉眼可见孔内有明显蓝色，即可终止 )。 依序每孔加终止溶液 50l，终止反应 (此时蓝色立转黄色 )。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 用酶联仪在 450长依序测量各孔的光密度( )。在加终止液后 15 分钟以内进行检 测。 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 15 实验的检测数据均以 x s 表示 , 组间比较采用单因素方差分析并使用两两比较，应用 件进行统计学分析。 P 0. 05 为有显著性。 表 2脑坏死体积比较 *注 :5 组间坏死体积比较 ,F（ =p照组 醇组 醇组 醇组 假手术组 图 5 家兔存活 12h 处死 ， 同一层面脑坏死体积比较 家兔数量（只） 坏死体积（ %） 假手术组 对照组 醇组 醇组 醇组 8 8 8 8 8 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 16 h、 8h、 12h 血清 白浓度变化 表 2自主循环恢复后 2h、 8h、 12h 血清 白浓度变化（ g/L） 2h 8h 12h 照组 假手术 2. 25 . 06 . 12 . 45 4. 03 . 06 0. 06 . 96 . 98 7. 25 . 06 0. 01 *注： 2h 时， 醇组与各组比较 F（ 4， 35） =8h 时， 醇组与各组比较 F（ 4， 40） = 12h 时， 醇组与各组比较 F（ 4， 40）= 目前心脏骤停后脑复苏的治疗并不令人满意。心肺复苏的主要目的是患者智能的恢复，提高患者远期生活质量。本研究结果与王飞等人研究结果一致 在本实验中，我们观察到乙醇 于心脏骤停后综合征脑保护效应最明显。从本实验家兔大脑 色切片可见皮质层缺血坏死呈弥漫状及点片状分布。 对照组 、 醇组 、 醇组 、 醇组脑坏死体积 分别是： 醇组 脑坏死体积最小 p 自主循环恢复后 2h、 8h、 12h 分别监测 4 组家兔血清 2h 时， 醇 组 、 醇组、 醇组、 对照组 ， 血清 度 分别 为 、 、 、 2. 25 。 醇 组血清 度最低 p 8h 时， 对照组 ， 血清 度为 分别为 、 2. 12 、 0. 45 、 4. 03 。 血清 度最低 p2h 时，醇 组 、 对照组 ， 血清 度 分别 为 、4. 96 、 0. 98 、 7. 25 。 血清 度最低 ,p从数据中可以看出乙醇 ，在自主循环恢复后 2h， 8h，12h，血 清 白浓度较其他组明显下降。 本实验最终得出结论： 乙醇对心脏骤停后综合征具有脑保护作用。 我们推测乙醇脑保护的机制可能有以下两种： 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 17 (1） 大脑神经元的兴奋和抑制之间的动态平衡是保持正常脑功能的关键。脑缺血打破这种平衡 。 乙醇通过加强抑 制性输入，使神经元的兴奋和抑制回到正确的动态平衡。即乙醇激活脑海马 体， 体的激活抑制缺血性去极化，然后降低 活化，发挥神经保护作用 29 (2） 乙醇的神经保护作用机制是通过抑制 路激活途径，减少位引起的细胞液 中葡萄糖水平的提高，降低了乳酸堆积导致神经细胞死亡 ，从而发挥神经保护效应 32 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 18 第三章 结论 醇在自主循环恢复后即刻注射，脑保护作用最显著 。 本实验家兔复苏后存活时间不长， 因此 无法进行神经功能评分 及 智能恢复的评估。 兰州大学硕士研究生学位论文 乙醇对 家兔心脏骤停后综合征 脑保护 的实验研究 19 参考文献 1. 高伟波 , 朱继红 . 心脏骤停后综合征 J. 中华内科杂志 2010, 49(8):7172. 苏汉银 . 脑复苏的新进展 硕士论文 . 河北医科大学 ; 2008. 3. 张新超 . 心脏骤停后综合征 J. 中国心血管杂志 2010, 15(5):3404. , , J,et of . 009, 6