【毕业学位论文】（Word原稿）生物降解菌株Delftia tsuruhatensis AD9中染色体编码的苯胺代谢基因簇的克隆和功能研究生物化学与分子生物学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 生物降解菌株 染色体编码的苯胺代谢基因簇的 克隆和功能研究 i 摘 要 从印染厂活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的细菌菌株 最高耐受苯胺浓度为 4500mg/l，在 18 小时内将起始浓度为 1000mg/l 的苯胺完全降解。经传统菌株 表型比较、 16S 列同源性比对（ 录号： 量测定以及标准菌株 交分析，将该菌鉴定 为 采用脉冲场电泳和 交实验结果表明，苯胺降解基因簇位于染色体上。本工作有关 苯胺降解能力以及苯胺代谢基因簇的染色体定位特征研究属首次报道。 利用苯胺不完全降解时中间产物的显色反应如当邻苯二酚（ 谢被阻断时 ， 邻苯二酚累积后自身氧化成棕色；和 2 代谢被阻断或邻苯二酚双 加氧酶过量表达时，因 积而呈现金黄色，建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法。从构建的 基因文库中筛选得到三个阳性克隆 ， 分别为含 入片段的棕色阳性克隆 大小为 入片段的金黄色阳性克隆 含 极测定重组子 苯胺双加氧酶酶活为 323 2/ (g h；内源呼吸 162 2/ (g h。 含苯胺的 体培养基上培养24 小时后， 析产物的化学性质：主要的特征离子在 m/z 92（ M+， 81（ M+，64（ M+，与邻苯二酚标准品的结果完全一致。比色法测定重组子 邻苯二酚2,3 双加氧酶（ 活为 3.2 mg 对三个阳性克隆 行核苷酸序列分析，经拼接获得一段大小为 录号 包含 25 个开放阅读框，其中至 少含有 17 个 与苯胺代谢有关的基因，命名为 因簇 两侧含转座酶和 列。调控基因 码赖氨酸型调控蛋白。 因簇的表达由一个启动子控制，编码多组分的苯胺双加氧酶。 因簇的表达由一个启动子控制，编码参与邻苯二酚间位裂解途径所有的酶系，其中 码的两组植物型铁氧化还原蛋白， 能是催化邻苯二酚的开环反应。余下的 因簇编码 2水解酶（ 2酮 4烯戊酸水解酶（ 乙醛脱氢酶（ 4羟基 2酮戊酸醛缩酶（ 4草酰巴豆酸脱羧酶（ 变构酶 ( 将邻苯二酚开环所产生的中间代谢产物 2。 苯胺降解基因紧密连锁成簇，两侧由转座酶基因（ 列环绕，具有典型的基因岛（ 征。 苯胺代谢基因簇 粒编码的苯胺代谢基因簇 序列和遗传组织上有很高的同源性，进化上可能来自同一个祖先。序列分析表明， 因簇是比 因簇更古老的基因型。 可能以基因岛为一个转座单元在不同微生物属或种间转移。在 胺代谢基因簇中有 5 个功能尚不明确的开放阅读框，在模式菌 P. 胺代谢基因簇中没有发现，表明基因岛作为一个转座单元在不同微生物属或种间转移的同时，可能还伴随着基因的转移或重排，这也可能是污染环境降解微生物的生物多样性形成的一个重要原因。 构建了苯胺降解 因簇启动子 达载体， 因簇的表达受苯胺诱导。 苯胺双加氧酶基因拷贝数增加的 重组菌 00mg/l 的 养基中 16h 内基本上将苯胺全部降解，而野生菌株 要 18h，表明增加苯胺双加氧酶基因的拷贝数可提高苯胺降解的速率。 D. 胺双加氧酶基因导入苯酚降解菌 A. ，重组菌 以苯胺为唯一碳源的 养基中能够生长，但苯胺的降解速率较野生菌 ，表明 苯胺双加氧酶基因在 低水平表达。 关键词： 苯胺， 生物降解，基因簇 D9 as an a at D9 ,500 l. ,000 l 8h. 6S of +C D9 6.8 is to 7 (66.2 . In D9 7 of as a . in NA of D9 By NA of a of at 7 of In to a a to In it is by it a . to D . 32 3 6 2 in as by . to . .2 mg 1 23O a 384a of D D9 in a no is on D9 In we a . is of a in is a by in to it is on a . a . it is iv to of is of 23Os to by 23O on 100%, 100%, 356%, 18%), 28%, 10基因岛在长度上为 10间。它们经常隐藏在噬菌体和 /或质粒驱动的序列，包括转移基因或整合酶和 件。这些特定的 域可能是不稳定的 ， 其不稳定性可能是被边缘直接重复序列介导的。这些重复序列常常和噬菌体的附着位点同源，由此促使其从细菌基因组整合位点中被切除。除了可 移动位点， 基因 岛往往携带着特定功能的基因簇。这些基因岛大多数在 G+C 含量和密码子使用上不同于宿主菌的基因组。相对于插入片断，基因岛在进化上的优点就是大量基因（如操纵子编码功能相关的基因簇）可以转移并整合到受体基因组上。这种转移可以导致受体功能发生急速变化，最总导致量子跳跃般的进化。 定位在这些遗传元件上的大多数基因簇编码对微生物存活和转移有关的基因。这样，在一个群体内，携带基因岛的有机体有一个选择优势。例如，在 ，编码吸收糖的 件对其在寄生环境中 代谢是非常重要的。而编码吸收离子的 基因 岛增 强了细菌在土壤或宿主中生长和传播的能力。许多肠道细菌和假单胞菌都 存在这种现象。 2001 年将基因岛分成四类 ，它 们是病原岛 ( 共生岛（ 、 腐生岛（ 和 生态岛（ (表 1图 1其中生态岛 最典型的例子就是芳香 族化合物 氯代邻苯二酚 降解 （ 菌 带的基因岛 （ et 1998） 。这个 因簇位于一个 105因单元上 （ 。 在有氯代苯存在的培养基中 ， 力的 P. 合后 ， 在 P. 发现了 7 拷贝 。提示 基因岛 在微生物对 芳香族 污染物的适应性进化中起着 重要 的作用。 它 能使宿主菌 产生新的分中国农业科学院博士学位论文 苯胺及其衍生物的代谢调控研究进展 19 解代谢途径以适应环境中新出 现的人工合成化合物的变化。这种基因适应性机制极大地扩大了微生物的底物范围 。 表 1基因岛编码的功能 by of AI CI CI AI AI AI CI CI YI AI AI AI 近 10 年来，已有大量的人工合成化学物质释放到环境中，许多微生物特别是细菌能够适应并利用这些化合物作为能源和碳源。降解质粒、转座子和基因岛携带基因在微生物界传递，这对遗传多变性 和适应性是至关重要的。这种基因适应性机制极大地扩大了微生物的底物范围，对分解途径的进化也起到很大作用。现在关于自然环境进化速度的数据很少，但在遗传过程中分解代谢的转座子和基因岛的进化势必增大代谢途径的进化，使微生物产生新的、高效的代谢途径。 中国农业科学院博士学位论文 苯胺及其衍生物的代谢调控研究进展 20 胺代谢表达调控研究的新技术和新方法 越来越多的新技术和新方法加入到对苯胺代谢表达调控的研究当中，推动了苯胺代谢研究更深入的开展。 胺降解代谢工程的应用 图 1因岛的进化模式图 of 中国农业科学院博士学位论文 苯胺及其衍生物的代谢调控研究进展 21 基因工程当前已经进入了一个高级阶段 代谢 工程。对于微生物苯胺降解的代谢工程的应用， 1998 年美国 学化学工程系的 出了很好的尝试。 1984 年由 离得到，而且在 发现参与苯胺降解的 100质粒 对该质粒进一步研究表明 ， 解途径为间位裂解。同年 他的博士论文工作中 ,利用化学诱变和转座突变对 行了研究， 1992 年他将 解苯胺的基因定位在 28区域上。 1998 年 为在降解系统中有毒底物的抑制可以产生多种稳定状态，在这种情况下 他 们对 苯胺连续代谢进行了研究。在两种不同的生长特征 （ 底物抑制和无底物抑制 ） 下 ， 各种不同的代谢参数和加速稀释状态下的短暂反馈，实验依据的调控机制的组成是在推测情况下，苯胺代谢到三羧酸循环中，苯胺是作为转录的诱导物 ， 一系列的酶在一个启动子下协同表达。利用一个含有 因 （ 的片段研究代谢途径中水平和检测 活性。在抑制特征下通量低于原来的 60，但是在 50 抑制状态下却增加了 合成和提高了 衰退率。对调控机制的研究表明， 苯胺和反馈抑制物 在下为非竞争性抑制，在非抑制特征下 代谢是限速步骤，相反的在抑制特征下，苯胺到邻苯二酚为代谢的瓶颈。 用蛋白组学技术研究苯胺代谢 胁迫条件下的微生物蛋白质组学是其中一个重要的研究领域。微生物可以 适应不同环境，包括极端恶劣环境 （ 极酸，高温，高渗，极端污染等 ） 。研究其在不同生长环境中的基因表达情况，可以阐明微生物适应环境的分子机制，有助于发现具有明显生物活性的蛋白分子，造福人类。目前对微生物蛋白质组学研究相当一部分集中在微生物胁迫生理方面。由于蛋白质组学的特点，决定了它比传统研究微生物胁迫生理方法更能够深入阐明微生物适应多样化环境的机制。 2002 年 人对 24 进行了苯胺诱导蛋白的蛋白组学分析。用含有苯胺和琥珀酸培养基对 导，应用二维电泳（ 2技术对可溶蛋白的组分进行分析。用银染的方法在胶上检测到 370 个点， 23 个点是在苯胺诱导情况下检测到的。利用 20 个苯胺诱导蛋白点，确定了 6 个邻位降解途径的基因，一个氨基转移亚基（推测为苯胺双加氧酶），还有 5 个未知蛋白。特别是在 的 2 个 1 和 2）也被检出。对 蛋白组学的分析表明，利用蛋白组分析对苯胺诱导基因的确定和它们在细胞中的功能研究都很有帮助。 文的目的意义 本论文拟开展以下研究： 从污染环境 中分离和鉴定新的苯胺降解微生物菌株； 克隆完整的苯胺代谢途径基因簇，分析细菌苯胺代谢的生物途径； 开展苯胺代谢关键酶的功能鉴定和表达调控研究。 中国农业科学院博士学位论文 苯胺及其衍生物的代谢调控研究进展 22 通过上述的深入研究， 逐步揭示苯胺代谢调控的分子机理， 为苯胺及其衍生物的高效降解微生物的遗传改造和工 程应用奠定理论基础 。中国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 23 第二章 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 苯胺是严重污染环境和危害人体健康的有害物质 ， 毒害人和动物 （ et et et 。因此世界各国政府和科学家十分重视对苯胺 降解的研究 （ et et et 。微生物对苯胺及其衍生物的处理具有巨大的潜力（ et 1984） 。目前已经在许多微生物菌属中发现能够降解苯胺及其衍生物的细菌（ 970； 984; et 1997; et 2003； et 1997； et 1983; et 1991； et 1984； et et 1975； et 2001; et 2002; et 2000） 。因此驯化筛选新的高效快速降解苯胺的菌株，研究对苯胺有高效降解能力的菌株特征，对含苯胺类废水的生物处理有重要的指导意义。 除了 自然界中存在 的 极端环境 ， 还有一类极端环境是由于人类活动，特别是社会经济活动引起的，我们称它为极端污染环境。例如， 含芳香族化合物的 工业废水的排放，使水体质量恶化，危及水 生生物的生存等。 从另一个角度来看 ，我们也可以把极度污染的环境作为 开发 利用 的 资源。这些通常被认为是生命禁区的环境中 ， 极端污染环境微生物 蕴藏着极其丰富的基因资源 。 产生新的对有机污染物的降解途径， 往往是 极端污染环境微生物 适应 有机物 污染环境 的策略。许多芳香族污染物降解基因簇被发现与插入元件或转座子相连，这类降解基因簇因此可以在细菌间快速传播，这种快速传播有利于新的降解途径的产生。因此这种由插入元件或转座子介导产生的代谢全能性可以被开发并在生物修复污染环境中起关键作用。 本研究 从活性污泥中分离到 一 株能以苯胺为唯一碳 源、氮源生长的苯胺降解菌株 菌株具有降解苯胺速率快，耐受苯胺浓度高的特性。通过对 的 16S 列 分析 ， G+C 含量测定，与标准菌株 交检测并结合表型鉴定，将菌株 属为 解苯胺细菌菌株 的分离和鉴定为进一步克隆与苯胺降解有关基因和研究高效苯胺降解的分子机理奠定了良好的基础。 同时我们 以从苯胺极端污染环境中分离得到的三株苯胺降解菌为研究对象。根据苯胺双加氧酶结构基因的保守序列和转座酶 （ 序列设计 物，扩增产物序列结合菌株的 16S 列系统进化，来分析在极端污染环境中苯胺降解基因的存在状况和转座子介导的平行转移。 料与方法 验菌株来源 广东某毛纺厂生产车间排放污水水渠边的黑色土壤。 株和质粒 中国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 24 表 2试菌株与质粒 in 培养基 富集培养基采用 养基 蛋白胨 10g/l、酵母粉 5g/l、 0g/l、 体培养基含 琼脂。 筛选培养基 加入苯胺的 碳无氮限制性培养基（ l , .4 g/l , l, l, 2O g/l, l, 2O l， 物化学试剂 酵母提取物，胰蛋白胨为 司原装 ； 琼脂粉为北京化学试剂公司，进口分装 ； 溴化乙锭（ 司生产 ； 段快速纯化 /回收试剂盒（ 自 苯胺，乙丙基硫代 543 吲哚 ， 氨苄青霉素，及平衡酚都购自北京鼎国试剂公司 ； 无水乙醇， 葡萄糖及其余生化试剂都为国产分析纯 。 （ 司原装 限制性酶： 为 司产品 接酶为 司产品 要仪器 菌株和质粒 特性 来源 高频转化宿主菌 中国农科院生物技术所微生物室保存 胺降解菌株 本研究 （ 梁泉峰 ,林敏 2005） 胺降解菌株 本研究 胺降解菌株 本研究 D. 7 ( 标准菌株 由首都师大生命学院宋未教授 惠赠 12 标准菌株 由中科院微生物所东秀珠教授 惠赠 隆载体 司原装 中国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 25 透射电镜为日立 H 7500 型， 721 分光光度计为上海精密科学仪器有限公司生产，毛细管增仪 （ 品的富集培养和菌株的分离纯化及其驯化 取 5匀的泥浆加入 500 10离心管中，充分振荡 30匀静置 15上清液 1 2015 无碳无氮筛选培养基中，加入的苯胺浓度设为 250、 350mg/30、 200床培养过夜后转接。在每一次进行转接时，将浓度提高 50、 100mg/度进行培养，经过一周的驯化，其降解能力提高到 550mg/l。用 板划线分离单菌落， 30 温箱培养过夜，根据形态、色泽及大小的差异，选择单菌落分别接到 5胺浓度为 500mg/l 的 体培养基上， 30、 200床培养过夜，再将这些已生长的培养液转接 板。将分离得到的细菌分别接种到含 500mg/l 苯胺的富集培养液中。 30摇床培养，待苯胺完全降解后 ， 按 2%接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养液中，如此反复驯化 15 天。 镜观察 将菌株接种于 不同苯胺终浓度 的 体培养 基 ， 30生长 48h，取菌液 1,000心 2上清，用 二醛前固定过夜，磷酸缓冲液冲洗， 1锇酸后固定 水、包埋、聚合、切片后，醋酸铀柠檬酸铅染色，用日立 H 7500 型透射电镜观察拍照。 胺的测定采用偶氮比色法 此方法简便，试剂稳定，精密度和准确度好。原理 ： 苯胺类化合物在酸性条件下与亚硝酸盐发生重氮化反应，再与盐酸萘乙二胺偶合生成紫色染料，根据波长在 545的吸收进行定量分析。 所用试剂： 精密 纸： 5%（ m/v） m/v）氨基磺酸铵水溶液 l 硫酸溶液 2%（ m/v） 乙二胺盐酸盐水溶液（ 1) 苯胺标准溶液配制： 于 25量瓶中加入 l 硫酸溶液 10准确称量）。然后加入 3苯胺（再一次称量）。用 l 硫酸溶液稀释至刻度，摇匀。计算出每毫升溶液中所含苯胺的量，作为贮备液于冰箱中保存。使用时用 l 硫酸溶液配成每 胺的标准溶液（用时现配）。温浴至全部溶解，澄清透明为止，并且过滤。可于冰箱较长时间保存。如有沉淀、浑浊，停止使用。 2) 标准曲线的绘制： 于 7 个 25塞比色管中，分别加入 0， 胺标准溶液（每毫升含 各加水至 10匀。用固体 无水 节 精密 纸测试），加入一滴 5%（ m/v） 液，摇匀，放置 3中国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 26 分钟。加入 m/v）氨基磺酸铵水溶液 升，充分振荡后， 放置 3 分钟。待气泡除尽，加入 2% 液 1 毫升，用水稀释至刻度，摇匀。放置 30 分钟，于 545长处，用 10色皿，以水为参比，测定吸光度。 3) 样品的测定 水样用中速滤纸过滤后，吸取滤液适量（含 25塞比色管中，加水稀释至 10步骤 1）操作。以蒸馏水代替水样，按相同步骤操作进行空白实验。由水样吸光度减去空白吸光度的差值，从标准曲线上查出相应的苯胺含量。 4) 计算： 苯胺类（以苯胺计， mg/l） =m/v m: 由校准曲线查得的苯胺量（ g） v: 水样体积 (型鉴定 挑取单菌落在 体培养基上反复划线纯化。对筛选出的单一菌株进行细菌形态、生理生化综合特征表型鉴定。包括 革兰氏染色、细胞形状、形成芽孢、鞭毛及数量、接触酶、氧化酶、荧光色素、脓青酶、果聚糖、精氨酸双水解酶、柠檬酸盐利用、甲基红试验、 验、吲哚试验、 O/F 试验、从碳水化合物产酸、作为唯一碳源生长、 41生长、硝酸盐还原、反硝化、淀粉酶、液化明胶、无机氮源生长。 该鉴定工作由中国科学院微生物研究所完成。 6S 克隆和序列分析 16S 克隆和序列分析流程如图 2示 细菌总 提取 用 裂解，十六烷基三甲基溴化铵（ 沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总1987）。 1） 取单菌落接种于 5应的培养基中，在合适的温度下培养。根据细图 26S 列分析流程 6S 境 样 品 细 胞 富 集 直接提取 提 取 6S 增 16S 克 隆 16S 序 列 测 序 序列比较 16S 据 库 中国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 27 菌的生长率不同，培养时间可由几小时到几天不等。 2） 取 液于 心管中， 13,000 心 2上清。 3） 沉 淀重悬于 。 4） 室温， 13,000 心 2上清。 5） 沉淀重悬于 550l 1 。 6） 加 17l 溶菌酶（ 35mg/ 37温育 30 7） 加 3l 蛋白酶 K（ 20mg/ 37温育 30 8） 加 30l 10% 37温育 30 9） 加 100l 5M 分混匀。 10） 加 80l 液，混匀， 65水浴 10 11） 加等体积（ 仿 /异戊醇（ 24:1），轻轻振荡混匀。 12） 室温， 13,000 心 10 13） 将上清液转移到一新 心管中，加入等体积酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1）轻轻振荡混匀。 14） 重复第 12）步。 15） 将上清液转移到一新 心管中，加入等体积氯仿 /异戊醇（ 24:1）轻轻振荡混匀。 16） 重复第 12）步。 17） 将上清液转移到一新 心管中，加入 积异丙醇，混匀后室温静置 60 18） 20， 13,000 心 20 19） 弃上清，加 500l 70%乙醇，轻轻颠倒数次（洗盐）。 20） 4， 15,000 心 20 21） 重复洗盐两次。 22） 倒置离心管，干燥 淀 1015 淀溶于 100l 1 冲液， 存备用。 16S 增： 使用毛细管 增仪 1）采用 16S 用引物（ 1991） 5- 52）反应体系： 模板 l（ 200 引物 l（ 50 l） 引物 l（ 50 l） l（ l） 10 l l（ 5mg/ 国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 28 20l 混匀后吸入毛细管，封口。 3） 应：（ 35 个循环） 94 预变性 0s 94 变性 0s 52 退火 0s 72 延伸 60s 35 个循环后 72 补充延伸 10保存 物的纯化 采用 物快速纯化回收试剂盒，具体步骤如下： 1） 按照 5:1 的比例在 应体系中加入结合缓冲液，充分混匀。 2） 混匀后，将溶液加入到离心吸附柱中，再将吸附柱套入收集管，于 12,000 心30s。 3） 倒掉收集管中的废液，再加入 300l 洗涤缓冲液， 12,000 心 30s。 4） 重复步骤 3）一次。此步骤中，应于 12,000 心 2充分除去洗涤缓冲液。 5） 小心取出吸附柱，将其套入一个干净的 1.5 心管，并加入 30 至 50l 洗脱缓冲液。放置 1，于 12,000 心 30s。 6） 取出离心 管，其中便是回收后的 物。 产物片段克隆 应用 物进行克隆，连接产物通过转化进入到 后在含 50 g/，碱裂解法提取质粒，用 酶切分析插入片断的大小。 接反应 按下表所示体积进行连接反应 2 l l（ 50 l（ 25 3U/l） 1l 0l 轻轻混匀， 4过夜连接。 受态细胞 的 制备 1） 从活化的 E. B 液体培养基中， 37h，冰上冷却培养物至 0。 2） 将培养物倒入无菌的 1.5 心管中。 中国农业科 学院博士学位论文 苯胺高效降解菌的分离和鉴定 29 3） 4， 4,000 心 10 4） 弃上清，收集菌体。 5） 用预冷的 0.5 l 悬菌体，离心，去上清。 6） 用 预冷的 0.5 l 悬菌体，冰浴 15心收集菌体。 7） 加入 200l 预冷的 l 浴放置，即得感受态细胞。 接产物转化感受态细胞 1） 取 5l 过夜连接产物于一管感受