【毕业学位论文】（Word原稿）益生乳酸杆菌筛选和苹果渣发酵工程研究微生物学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 硕士研究生学位论文 益生乳酸杆菌筛选和苹果渣发酵工程研究 F I 摘 要 研究的目的： （ 1）建立 并采用 新的乳酸杆菌筛选模型，筛选益生乳酸杆菌 以作为主要的发酵菌种 ；（ 2）建立 粟酒裂殖 酵母发酵降解苹果渣中的有机酸技术，为后续乳酸杆菌发酵提供适宜的境条件 ；（ 3）建立应用筛选的益生乳酸杆菌发酵苹果渣的实验室工程技术，使得发酵 产物具有抑菌活性 。 主要结果和结论： 建立 并采用 新的乳酸杆菌筛选模型 ,从 5 个猪粪样品中筛选出的 18 株乳 酸杆菌其中有 15 株能够清除培养物中三种致病性大肠杆菌 987P，对筛选的乳酸杆菌有关的生物特性进行了研究。 同时分离到一株酵母菌 能够促进筛选乳酸杆菌的增殖和抑制大肠杆菌活性。 本研究选择到一株 粟酒裂殖酵母 菌株能够有效降解苹果渣中的 解率达 使得苹果渣的 大上升到 机酸下降约 60%；研究了 粟酒裂殖酵母 发酵工 艺，最佳发酵参数为： 亚硫酸用量 100mg/种量 07 个 g，发酵温度 28 ，批次发酵时间 24 h，不搅拌。 将 粟酒裂殖酵母 发酵后的苹果渣调整 种筛选的乳酸杆菌 酵母 行联合发酵能显著提高发酵产物的抑制大肠杆菌的活性；该联合发酵产物含有乳酸，含量为 不含苹果酸和乙酸；乳酸杆菌 耐热的 抗菌物质 ，该物质的产生 与乳酸杆菌的生物量和菌体稳定期的长短两个因素有关 。发酵产物中的益生乳酸杆菌 的生物量为 108g。 经过发酵，苹果渣总黄酮保存率为 游离 型黄酮的含量升高 20%。 发酵的产物含有乳酸、 抗菌物质 、类黄酮 和益生乳酸杆菌等抗生素替代品的多种元素， 提高了苹果渣的功能活性水平。 研究的意义： 新的筛选模型的建立提高了益生乳酸杆菌的筛选效率 ，具有新型安全抗菌微生态制剂研制的方法学意义 ；通过开发苹果渣利用的新途径，有助于解决苹果渣带来的环境污染问题；通过提高苹果渣发酵饲料的抑菌活性以及微生态因子，期望能够 提高苹果渣作为饲料原料或其他的应用价值 ；采用固态发酵技术处理苹果渣为生物饲料符合绿色、环保、可持续发展的目标。 关键词： 乳酸杆菌，筛选，苹果渣， 发酵 (1) to a of of to as to (2) to up a of by to pH (3) to P in to P A is to of 18 5 88、 987P of of of 1, is at of is to pH so as to P A 757 is , 0% P, pH .0 to of 2100mg/10%; 28 ; 24of pH P 757, A of 29 1 to P, as a by of sp in 108g. 0% P. of as of P of of is a to P, P be P of to P as P of of 录 第一章 引言 . 1 1 研究的目的和意义 . 1 2 饲用抗生素替代品研究进展 . 1 3 乳酸杆菌的筛选研究进展 . 3 4 苹果渣的利用 . 6 5 固态发酵研究进展 . 10 6 粟酒裂殖酵母发酵降解 . 11 7 苹果多酚物质 . 11 8 研 究的内容和方法 . 13 第二章 抑制大肠杆菌的乳酸杆菌的筛选 . 15 1 材料和方法 . 15 . 16 . 23 4 结论 . 24 第三章 乳酸杆菌的有关生物学特性研究 . 26 剂 . 26 . 26 3 结果 . 27 . 29 . 30 第四章 粟酒裂殖酵母的选择及其发酵降酸工艺研究 . 31 器和方法 . 31 2 结果 . 33 . 36 . 37 第五章 乳酸杆菌和酵母菌联合发酵苹果渣的研究 . 38 1 主要仪器、材料和方法 . 38 2 结果 . 40 3 讨论 . 45 4 结论 . 47 V 第六章 结论与展望 . 48 . 48 2. 提高苹果渣功能活性水平的苹果渣发酵工程及其可能机理（图示） . 49 3. 展望 . 50 参考文献 . 51 致 谢 . 57 作者简历 . 58 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 1 研究的目的和意义 本研究的目的（ 1）建立并应用新的乳酸杆菌筛选模型，筛选益生乳酸杆菌，为苹果渣发酵提供优良菌株；（ 2）建立粟酒裂殖酵母发酵降解苹果渣有机酸 的技术，以避免理化方法降低酸度带来的功能活性物质（纤维素改性、维生素和多酚物质）的破坏，同时为后续乳酸杆菌发酵提供适宜的 境条件和营养；（ 3）建立益生乳酸杆菌发酵苹果渣的实验室工程技术，得到具有抑菌活性的苹果渣生物饲料。 本研究的意义：（ 1）建立乳酸杆菌抑菌活性筛选模型，作为一种新的方法尝试用于本研究筛选应用，具有新型安全抗菌微生态制剂研制的方法学意义；（ 2）将所筛选优良乳酸杆菌的产酸产细菌素发酵代谢途径与优选的粟酒裂殖酵母的降酸发酵代谢途径有机结合，建立一种专门针对于提高苹果渣附加值的新型发酵系统工程 ；（ 3）本课题尝试研究建立开发利用苹果渣的新途径，以利于解决苹果渣废弃带来的环境污染问题；利用以上新型的发酵系统工程预期能够得到具有苹果渣原料的功 能性物质成分、抑菌物质以及微生态因子，提升其作为饲料资源的价值 ；本课题的总体研究思路和预期结果符合新型生物饲料安全、环保和畜牧业可持续发展的目标要求，具有一定的理论和实际意义。 2 饲用抗生素替代品研究进展 题的提出 40 年代末人们发现四环素对畜禽生长具有促进作用，从而开创了抗生素作为饲料添加剂的时代（李千军等， 2001）。 1950 年美国食品与药物管理局（ 次批准抗生素用做饲料添加剂后世界各国相继进行抗生素的饲喂实验，并用于畜牧生产。饲用抗生素通过抑制病原微生物的增殖，减少其代谢毒素对动物的毒害作用而在防治动物疾病，促进动物生长，提高畜产品质量等方面起到了积极作用，给养殖业带来了许多的便利和巨大的经济效益。但是长期使用尤其是滥用抗生素带来的负面作用不可忽视，其负面作用主要有：抗生素的使用引起细菌产生耐药性；饲用抗生素的残留，直接威胁人类健康，破坏生态环境；破坏机体内正常菌群的生态平衡；对动物的机体免疫力产生不良影响（佟建明等， 2001；熊家林等， 2001；张力等， 2000；郭兴华， 2002）。因此各国一方面加强饲用抗生素的管理，另一方面加强饲用抗生素替代品的研究和开发。 目前正在研究和开发的饲用抗生素替代品包括：微生态制剂（益生菌， 低聚糖、饲用酶制剂、饲用酸制剂、中草药饲料添加剂、糖萜素等植物提取物（ 李千军 等 ， 2001； 张建东等 ， 2001； 张昌莲 ， 1999； 林元银 等， 2001； 刘亚力 ， 1999； 王洪生 ， 2000； 石现瑞 等 2000）。下面就 动物微生态制剂、 饲用酸制剂、中草药糖萜素等植物提取物等方面进行综述。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 物微生态制剂 动物微生态制剂是我国专家 1988年提出，是指在微生态理论指导下利用对宿主有益的活的正常微生物或正常微生物的促生长物质经特殊工艺制成的制剂，可起到调整动物肠道微生态平衡的作用。微生态制剂按有无活菌分为益生素、灭活益生素及益生元（化学益生素）。 添加微生态制剂（或益生素）可以显著地增加日增重和饲料转化率，降低干物质和氮排泄量、降低腹泻率，提高仔猪成活率、提高仔猪采食量和增重，提高雏鸡成活率，料肉比及日增重（ 1992）。 微生态制剂（主要是益生素）提高畜禽生产性能的生理机制：对动物消化道微生态的调节 ，提供营养，促进生长， 增强动物的免疫系统功能， 促进幼畜消化道发育和结构优化 ， 合成维生素提供给宿主，防止有害物质的产生。 益生素在肉鸡、仔猪、犊牛等养殖业中有防病治病、提高生产性能，增强机体免疫力，替代饲用抗生素，减少粪中产生的臭味等效果（ 郭兴华， 2002）。 用酸制剂 饲用酸制剂分有机酸和无机酸。有机酸有柠檬酸、延胡索酸、乳酸、异位酸等，无机酸有磷酸。饲用酸制剂的作用：可降低胃肠道的 ，有利于肠道有益菌的繁殖，抑制某些病原菌的生长，促进食欲，提高蛋白质的消化率和蛋白质沉积，有利于微量元素的吸收，增 强抵抗疾病的能力，激活一些重要的蛋白酶，有利于营养物质的消化（ 张建东等 ， 2001； 张昌莲 ， 1999； 林元银 等， 2001）。 草药饲料添加剂 据不完全统计我国已有 200 余种中草药用于畜禽添加剂，有 5000 多种中草药可用于畜禽添加剂的生产。作用有：理气健脾促进消化，补气壮阳、养血滋阴、增强体质，扶正驱邪、驱虫消积、促进畜禽健康，安神定惊、开关利窍，清热解毒、杀菌抗病等。研究表明中草药添加剂对兔、禽球虫病，牛、猪流行性腹泻等病有明显治疗效果（ 张昌莲 ， 1999）。 萜素等植物提取物 糖萜素是从油茶饼 粕和茶籽饼粕中提取的含糖类、三萜皂甙和有机酸等生物活性物质，作用有：对机体的免疫功能，提高动物体内酶活性，改善消化吸收功能，抗应激作用，抑制病源微生物作用 菌浓度： 沙门氏菌（抑菌浓度： 某些球虫、病毒等有害菌群。大蒜素、茶多酚、山楂叶黄酮、大豆异黄酮等植物提取物促进动物的生产性能，替代抗生素的功能研究开发也在进行之中（ 王岳飞 ， 1994；刘根桃等， 1997；刘燕强等， 1998；谢奉祥， 2001）；类黄酮是中药和植物中普遍存在 的功能性的成分，有着作为功能性食品添加剂和新型饲料添加剂的潜力，是目前研究的一个热点（石碧等， 2000；张德全等， 1999）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 3 乳酸杆菌的筛选研究进展 为了提高动物微生态制剂应用的有效性，针对寄主特异性，从不同动物体内、体外进行乳酸菌的筛选以期望得到优良的菌株，是目前国内外研究的热点（陈世琼， 2000；杨华， 2000 黄沧海，2003； M. M. 2003； et 2003； et 2003；禹慧明等，2002）。传统的筛 选模型效率低且工作量大已经成为益生菌筛选工作的瓶颈，直接影响到益生菌的应用。本文通过总结并比较前人做过的三个典型的乳酸菌筛选模型，探讨如何提高筛选效率，并把实践中常见的筛选方法作一简要概述。 选模式和筛选效率 总结的三个典型的筛选模型分别命名为模型 A（陈世琼， 2000；杨华， 2000），模型 B（黄沧海， 2003）和模型 C（ M. M. 2003），它们的共同点是筛选模式相同，为传统的“先分离后筛选”；不同点在于采用的筛选指标及其筛选的顺序不同。为了便于评价筛选模型的效率，作者提 出益生菌筛选效率的计算公式为： 公式中： a 为筛选结果中符合需要的菌株的数量， b 为待筛选的菌株的数量。 表 1选模型和筛选效率 of 型 /发菌株 /of 合需要的菌株 /of 选效率（ %） /of %） 模型 A/ 200 38 19 模型 B/ 7009 4 型 C/ 686 4 1选模型和各自的筛选指标 of 型 /选指标，筛选效率（ %）及其顺序 /of 型 A/ 益生性 19 黏附和耐药性 模型 B/ 耐酸 70、耐胆盐 高铜 50、益生性 43 模型 C/ 益生性 40、菌株纯化 27、耐酸和耐胆盐 25、耐药性 21 表 1出了三个不同的筛选模型及其筛选效率。表 1出了筛选模型和各自的筛选指标及其筛选效率和顺序。由表 1以看出，模型 A 只有一个筛选指标，筛选效率为 19%，模型 ) 第一章 引言 4 和模型 C 的筛选效率小于 1%， 99%以上的工作量是徒劳的。表 1明，各指标的筛选效率有明显的差异，按筛选效率的高低筛选指标依次为耐酸、益生性、耐药性、耐胆盐。 作为动物微生态制剂的待选菌株，往往要经过多项指标的筛选，其中益生性、耐酸、耐胆盐是最常用的筛选指标。耐药性也 是一项重要的指标，但目前并没有关于乳酸 菌耐药性的统一检测标准。此外定植性也是应该考虑的筛选指标，但技术要求的难度较高。 对于模型 B 和 C 从总的筛选效率考虑要筛选到理想的菌株工作量很大，并且 99%以上的工作量是徒劳的，筛选效率极其低下。可见“先分离后筛选”的筛选模式很不经济。 鉴于“先分离后筛选”的筛选模式的缺点，作者提出了“先筛选后分离然后再进一步筛选”的筛选模式，现将该模式从理论上阐述如下： 一般待筛选的菌株都要经过同样的筛选指标的筛选及筛选程序，可以将方便集成的指标同时进行筛选，比如耐酸、益生性、耐胆盐筛 选指标。具体做法是将待筛选的样品不经过分离而直接经过一个简单的且工作量很小的初步筛选，作用是将不符合需要的菌株淘汰，将符合需要的菌株保留下来并加以富集，随后分离单菌株并进一步筛选。这一筛选模式为“先预筛选后分离再进一步筛选”。理论上该筛选模式可以显著提高筛选的效率，另外这一筛选模式还可能有以下优点：避免漏筛，初步筛选的待筛菌株为样品中的所有菌株，同时也避免了取样的不科学性；可以预先知道样品是否含有目的菌株，避免筛选的盲目性；具有可评价的特点，待筛样品经过耐酸、耐胆盐的筛选后，益生性指标可以作为评价的指标，分 离的菌株的益生性指标可以与初筛结果相比较，从而保证筛选到优良的菌株。 对于一个动物微生态制剂的筛选模型，应该经过耐酸、益生性、耐胆盐、耐药性、定植性等指标的筛选过程；而筛选效率的高低并不取决于筛选指标，而是取决于筛选模式；而“先筛选后分离再进一步分离”在提高筛选效率上可能显著优于“先分离后筛选”的模式。 生性筛选 益生性指乳酸菌通过有机酸、过氧化氢和细菌素等代谢产物对病原菌的抑制特性。益生性筛选首先涉及到指示菌的选择，这取决于筛选的应用目的。益生性筛选的方法，常用的有牛津杯扩散法（祝嫦巍等， 2002）、菌落抑菌法（ M. M. 2003）、平皿挖沟法（黄沧海， 2003）、联合培养竞争抑制法（黄沧海， 2003）和二乙酸荧光素水解法（徐利华等， 1997）。其中平皿挖沟法可以用于不超过三个指示菌的益生性筛选，菌落抑菌法和二乙酸荧光素水解法适合高通量的筛选，而联合培养竞争抑制法是检验待筛益生菌菌株清除指示菌的能力且最终决定优良菌株取舍的方法。 胆盐筛选 常用耐胆盐筛选的方法有两种，一是最低抑制浓度法即 （ B., et 2000），以在含有胆盐的 养基上所能生长的最大胆盐浓度表示，最低要求 不低于 二是分光光度计法（ S. E., et ， 1998），通过测定待筛菌株在含 盐的 体培养基中在不同培养时间（ 1、 2、 3、 4、 6h）的 ，然后作图，和对照（不加胆盐）比较，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 分别计算二者达到 的时间（与 0 h 培养基的 比较），并计算二者的差值（以示），判断标准为：差值 15耐胆盐； 15值 40中等； 40值60弱 ；差值 60敏感。其中， 较为简单实用；而分光光度计法要求条件比较复杂。 酸性筛选 常用的耐酸性筛选是测定经过一定时间（一般 4h），在一定 （ ）的 汤培养后的存活率（黄沧海， 2003）；另外一种就是分光光度计方法（ M. M. 2003），测定待筛菌株在不同 （ 2、 4、 5， 7 为对照）条件下 冲液中在不同培养时间（ 2、 4、 24h）的 ，根据以下的标准进行判断：在 24h 内，在所有 水平上 上升的为最优；在 24h 内，在 3 个 水平上 都上升的为较优；以下情况可以认为良好 4h 内，在 2 个 水平上 都上升；在 24h 内，在 1 个 水平上 h 内在 2 个以上 水平上 都上升；在 4h 内在所有 水平上 药性筛选 耐药性直接关系到食品安全因而在乳酸菌应用中日益受到关注。通常选用的最有代表性抗生素为红霉素（ 甲氧苄啶 格雷沙星（ 氨苄青霉素（ 左氟沙星（ 四环素（ 共六种。选择这 6 种抗生素的标准是抗生素的对人类药物的重要程度（ M. M. 2003）。 最常用的耐药性检测方法为纸片法，用于实验的抗生素通常采用标准的药敏纸片（凌代文，1999）。判断的标准： G+菌参照金黄色葡萄球菌 株， 细请参考 纸片法所用的培养基为半固体 养基（ 脂）， 9平皿装量为 25体密度为 106华，张篪， 2000）。 植性筛选 定植性是乳酸菌在肠道内能够发挥作用的前提条件，一般用体外条件下与肠上皮细胞（ ）黏附的乳酸菌的量来表示（郭兴华， 2002）。黏附实验的基本步骤为：首先进行肠上皮细胞的培 养，然后将培养好的肠上皮细胞加入 24 孔板贴壁固定，第三，加入乳酸菌进行共培养，第四，倒去培养液并用缓冲液冲洗肠上皮细胞表面；最后，观察并计算每个细胞黏附的细菌数目（杨华，张篪， 2000）。 基于乳酸菌的自身凝聚力和对肠上皮细胞的黏附力呈正相关（郭兴华， 2002），可以用乳酸菌的自身凝聚力作为乳酸菌定植能力的评价指标。自身凝聚力的检测方法（ B., et 2003）中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 如下：乳酸菌用 汤在 37 培养 18h，收集菌体（ 5000r/15然后用 浮，使得菌体密度达 1084体悬浮液用涡流振荡 10 s，在室温下按如下操作测定自身凝聚力：每 h（包括 0 h）取 0.1 层悬浮液加入 3.9 测定 身凝聚力的百分比用以下公式表示： （ 1 0） 100，其中 表 1， 2， 3， 4， 5 h 的 表 0 4 苹果渣的利用 苹果渣（ 苹果加工业的副产品，由苹果皮、果心和果肉等组成（王晋杰等， 2000）。我国是世界上最大的苹果生产国，年产苹果 20， 431， 230 吨（中国统计年鉴 ， 2001，9）。目前有 10%进行加工处理，出渣率 20总产量十分可观（王晋杰等， 2000）。据杨福有等（ 1998）对陕西苹果生产利用现状调查，初步估计用苹果渣作肥料、燃料的占 15% 20%，作饲料用为 10%，当垃圾处理占到 70%，即每年有 15 万吨苹果渣当垃圾处理，污染环境。 果渣的特点 苹果渣有以下特点：富含水分、可溶性糖、有机酸、矿物质和维生素 C，蛋白质含量低，酸度大。 果渣的成分与利用 关于苹果渣成分有不同的报道（杨福有等， 2000；李彩凤等， 2001；王晋杰等， 1981；吴卫华， 1996； F. A. et 1998； et 1992）。表 1举了苹果渣的一般成分，由表 1以看出苹果渣含有丰富而廉价的微生物可利用碳源，苹果渣中还含有促进微生物生长的丰富的矿物质和生长因子。另外苹果渣中含有的膳食纤维一直是营养学家提倡摄取的保健因子，对于潜在的饲用抗生素替代品的低聚糖也可以由苹果渣中的纤维素经适当降解而来。 苹果渣干粉的代谢能（牛）值（ 近于玉米（ 麸皮（ 1.7 果渣粉相当于 1米粉的营养价值，苹果渣可直接作为牲畜如猪、奶牛和羊的青饲料或干饲料。但苹果渣蛋白含量低，苹果渣干粉替代麸皮和玉米不能超过一定的比例。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 表 渣的一般成分 P 成分 /均含量 /分 /%） 溶性糖 /%） 定酸 /%） 胶 /%） 粉 /%） 纤维 / %） 蛋白 /%） 坏血酸 /00g） 物质 /K（ %） a（ %） a（ %） g（ %） e（ mg/ u（ mg/ n（ mg/ 15 n（ mg/ ：表中结果以干苹果渣测定； 95%置信度；水分以湿苹果渣测定。 表 1苹果渣成分与利用的一览表。由表 1以看出，苹果渣的利用有很多途径，概括起来主要有三方面：（ 1）直接利用途径：直接提取膳食纤维，但是常规的酸或碱法提取会对环境造成污染；直接用做饲料有明显的不足，如蛋白质含量低；做 食品也很少使用；直接利用非常有限。（ 2） 采用发酵的方法来提高苹果渣的利用价值：生产单细胞蛋白，有机酸，酒精，酶制剂等；（ 3） 苹果渣利用出现的新趋势：近年来苹果渣利用往功能性食品或饲料发展，比如，苹果渣对脂肪代谢的功能性研究，苹果渣发酵生产 苹果渣中提取多酚物质及其功能性质的研究，苹果渣作为仔猪腹泻治疗物质的一种成分的研究等等。但是利用发酵提高苹果渣的功能活性水平的研究还没有见报道，利用苹果渣发酵生产功能性的饲料原料是很好的选择。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 8 表 1果渣成分与利用 P 苹果渣成分/P 苹果渣利用 /P 文献 / 溶 性 糖 /酵生产酒精、柠檬酸、果醋、单细胞蛋白、苹果渣青贮 侯红萍等， 1998； . A., et 2002； et 19952000； et 1994；., et 1995； et 1992； 傅斌等， 1989；籍保平等， 1999；陈喜英等， 2000； 果胶 / 取果胶、生产果胶水解酶、改善脂肪代谢 陈雪峰等， 2000；孔臻等 , 2000； et 1998；et 2001； et 2000； et 2000； et et 1997 纤维 素 、 木 聚 糖 / 取食用纤维、生产食用菌和低聚糖、生产纤维素酶、做植物生长基质改良剂、制活性炭和天然气、减肥食品、改善食品品质、提取木聚糖 康正平等， 1997；邓红等， 2002；史红兵等， 2002；李文哲等， 2000； et 2001； et 1998、2002； et 1992； et 1992； et 1995； et 1999 角质 /产角质酶和角质酯酶 et 1999、 2000 苹果酸等有机酸，不含植酸 /为治疗仔猪贫血的载体 et 1997 酚类物质/植物生长促进剂、分离花青素前体等物质做保健药物 et 2000； et 1997、 1999、 2000；et 1997 苹果酶系 /P 生产香料 et 1996 苹果渣 /苹果果酱、生产 为仔猪腹泻治疗物质的一种成分、作为生防制剂基质 et 2000； et et 2002； et 1999 果渣青贮 杨福有等（ 2000）研究了苹果渣的青贮与饲喂技术，认为苹果渣青贮之后适口性有所改善。中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 9 青贮苹果渣对牛、羊、猪等家畜可以长期饲喂，无任何毒副作用。陈喜英等（ 2000）认为苹果渣青贮饲料饲喂奶牛可以提高奶牛的产奶 量。 苹果渣青贮的原理是：鲜苹果渣压实在青贮窖中，乳酸菌使苹果渣中的糖类转变为乳酸。由于乳酸的不断产生酸度加大抑制了其他微生物的繁殖，当 苹果渣的微生物在厌氧条件下几乎完全停止活动，从而使苹果渣能长期保存。苹果渣青贮时间一般 30天以上。余伯良（ 1999）认为青贮饲料调控的要点为：原料有一定的含糖量，含水量为 65温度为 19，缺氧或密封。 果渣发酵生产单细胞蛋白 单细胞蛋白（ 叫微生物蛋白，单细胞蛋白的研究是为了解决饲料粮食 和蛋白质缺乏的问题。国内籍保平等（ 1999）对苹果渣发酵生产饲料蛋白进行了详细的研究。国外也有很多相关报道（ V. K., et 1997, 2000; H., et T. C., et 籍保平等（ 1999）筛选菌种包括丝状真菌、酵母菌和细菌，筛选的标准为能在苹果渣原料为培养基的基质上生长和生产较多的粗蛋白。通过双菌混生实验选出适宜的菌种组合，籍保平等（ 1999）筛选出的菌种为白地霉和康宁木霉。 T C, et 酵母菌和产纤维素酶的霉菌进行双菌混生培养筛选，标准为发酵产物的粗蛋白含量，结果以黑曲霉和产假丝酵母（ 合为最优。 K, et 2000）对五种酵母菌（ 分别发酵苹果渣进行了研究，发现不同菌种发酵的产物有不同的特点：粗蛋白含量以 C. 最高，可溶性蛋白含量以 纤维含量以 S. 最低，粗脂肪和维生素 C 以 C. 最高。需要指出的是：不少 的菌种（包括 C. 在内）属于机会性致病菌，由此所引起的假丝酵母症疾病 现为敏感感染部位的瘙痒等症状（王建华， 2002）。 而在有些国家有关应用微生物研究和生产领域还将其当作转化低值生物资源的有益微生物在广泛应用值得引起注意；作为 员国， 我们必须也应该参考或按照国际标准生产和销售农业产品。 苹果渣含水量高、酸度大、缺氮元素，不合适直接作为发酵原料，必须添加无机氮源、调整水分和酸度。籍保平等（ 1999）研究了发酵培养基添加的无机氮源和添加量，发酵培养基配方，选择的标准为粗蛋白含量和产品的风味。该研究尝试加入其他的农产品加工的副产品如麸皮等。 籍保平等（ 1999）苹果渣发酵的工艺条件包括：菌种接种比例、接种量、料水比、 、发酵时间、静止发酵料层厚度等。该研究采用了单因素分析的方法确定了工艺的最佳条件，判断优劣的标准为发酵产物的粗蛋白含量。 苹果渣发酵单细胞蛋白的研究的借鉴意义有：研究目的决定了菌种选择、培养基和工艺条件