【毕业学位论文】（Word原稿）中国小麦品种条锈鉴定及抗条锈新基因 YrZH84的分子标记作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 中国小麦品种条锈鉴定及抗条锈新基因 分子标记 of of of of II 要 条锈病是由条锈菌 （ f. 引起的重要小麦病害，在我国曾多次大流行。了解现有品种或高代品系的抗性状况和基因分布，发掘新的抗病基因对培育抗锈品种具有重要意义。本研究共包括两个方面的内容，即 145 份品种（系）的苗期和成株期鉴定及优异小麦亲本周 8425B 中抗条锈基因分子标记。 本实验从我国 13 个省征集 145 个小麦品种和高代品系，用 26 个条锈菌种对其中 98 份材料接种鉴定、进行苗期抗条锈病基因推导； 2003 2004度在北京和甘肃天水对其中 137个品种（系）进行条锈病成株抗性鉴定。苗期基 因推导结果表明， 9 个基因以单独或组合形式存在于 72 个品种中，在另外 26 个品种中没有发现已知抗病基因； 42个品种含有 些品种经 1B/1属于 1B/1在于 19 个品种或品系中，这些品种（系）大多是 载体品种 92922后代；此外，两个品种携带 4 个品种含有 3 个品种携带 有 1 个品种含 1 个品种带有 两个品种含有 株抗性鉴定结果显示， 33 个品种（系）在两地连续两年表现慢锈性；相关分析表明，最终严重度（ 病程曲线下发展面积（ 相关性极显著（相关系数分别为 说明在小麦慢条锈育种中，以作为慢病性鉴定的简单指标。 利用国内条锈菌流行小种条中 32（ 周 8425B 和中国春杂交后代的 3群体进行苗期抗性鉴定，并用 记分析 3群体，进行抗条锈基因分子标记，用作图软件行连锁分析、构建抗 病基因所在染色体的遗传图谱。结果表明，周 8425现中抗的显性抗病基因，位于 7色体上，暂定名为 基因与7传距离为 1.4 12.0 中在 侧最近的 记为 遗传距离分别为 1.4 4.8 前定位于 7B 染色体的已知抗条锈基因有 苗期用 25 个条锈菌种对周 8425B 和携带 载体品种进行抗性鉴定，抗谱分析结果表明， 抗谱不同于 外， 染色体上的 置也不相同，说明 一个新的抗条锈病基因。 关键词 普通小麦；条锈病抗性；基因推导；慢条锈；基因分子标记 f. is of in .). of in or is to of 45 as as of A 45 in 2 In 98 6 f. of at in to to in 003004or in 2 in 6 r9 2 9 to r9 a 80.) 2922on of in to in in at in s DS at DS be as a of in F2 3 425B/ST 2) in of 425B. A 90 to as as SR 2 3 425B a ST on to SR on BL .4 cM 2.0 SR .4 cM .8 cM At r2 r6 to B. 425B r9 5 in a V 5 r2 In r6 is a .); 录 第一章 绪论 . 1 1 抗病遗传研究历史与方法 . 2 因推导分析 . 2 规杂交分析 . 3 整倍体法 . 4 胞分子遗传学 . 4 工酶标记 . 4 记 . 4 2 小麦条锈病抗病基因研究进展 . 7 3 小麦抗条锈基因的分子标记 . 11 4 慢锈基因的 位 . 13 5 持久抗性的机制及育种策略 . 14 久抗性的可能抗病机制 . 15 久抗性品种的选育 . 16 6 本研究内容和意义 . 17 第二章 我国小麦品种抗条锈基 因推导及成株抗性鉴定 . 18 1 材料与方法 . 19 麦品种及供试菌系 . 19 种繁殖 . 23 期接种和鉴定 . 23 B/1R 易位检测 . 24 间接种与抗性鉴定 . 26 . 26 因推导结果分析 . 26 株抗性鉴定结果 . 28 3 讨论 . 42 期基因推导 . 42 株抗性鉴定 . 43 国的抗条锈 育种策略 . 45 第三章 小麦品系周 8425B 抗条锈基因的分子标记 . 46 1 材料与方法 . 46 料 . 46 病性鉴定及遗传分析 . 46 条锈基因的分子标记 . 47 2 结果与分析 . 49 8425B 中抗条锈基因遗传分析 . 49 锁分析和遗传作图 . 49 25 个条锈菌种的反应型 . 52 病基因 来源 . 52 3 讨论 . 54 于 7B 染色体上的 比较 . 54 国小麦抗条锈病育种 . 54 第四章 结论 . 55 1 98 个中国小麦品种（系）苗期基因推导结果 . 55 2 135 个小麦品种（系）成株抗性鉴定结果 . 55 3小麦品系周 8425B 中抗条锈病基因分子标记 . 55 参考文献 . 56 致 谢 . 67 作者简历及发表学术论文 . 68 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 of 差分析 株抗性 害发展曲线下面积 2 条中 32 号 终病害严重度 of 温成株抗性 IT 染型 差显著性分析 f. 麦条锈菌 量性状基因位点 机扩增片段长度多态性 对病害发展曲线下面积 制性片段长度多态性 病基因类似物标记 卫星标记 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 小麦条锈病（ f. 一种分布广泛的气传病害，几乎在所有小麦主产国都有发生，冷凉 潮湿 和高海拔地区尤为严重。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，尤其在西北和西南地区条锈病连年发生（ ， 2004）。条锈病对小麦的危害突发性强，流行速度快，损失严重。中度流行年份可减产 10较大流行年份可减产 30%，在特重条件下，可造成颗粒无收。 20 世纪 50 年代至今，我国曾发生多次条锈病大流行，其中 1950、 1964、 1990 和2002 年四次大流行发生面积最大，危害也最重，前两次发病面积达 2 亿亩以上，后两次发病 别损失小麦 600、 300、 265 和 100 万吨（万安民等， 2003； ， 2004）。小麦条锈病是影响小麦产量和品质的主要限制因素，培育抗病品种是减少小麦条锈病危害的重 要举措。 虽然条锈病可以用药剂防治，但是选育抗病品种是防治小麦条锈病最经济、安全、有效的方法。由于小麦条锈菌的高度变异性，品种的抗病性并不能一劳永逸，特别是大面积种植单一品种，加速病原物小种的定向化选择，并哺育优势小种种群的增长，结果导致一个抗锈品种在生产上大面积应用较短时间之后往往 丧失 原有抗锈性，失去应用价值。从我国小麦条锈病的发生历史来看， 1950 年至今共发生 10 余次小麦条锈病较大流行，每次条锈病大流行都与病菌新小种的产生和发展以及随之造成的品种大面积抗性 丧失 有关（赵文生， 2000）。近几年，随 着小麦条锈菌毒性谱很广的新生理小种条中 31 号、条中 32 号和水源 11 致病类群出现及其频率的迅速增大，原本抗条锈病的 繁 6及其衍生系以及 水源 衍生系品种都已丧失抗性，导致了 2002 年在全国范围内的小麦条锈病大流行（ ， 2004）。 2005 年小麦条锈病波及全国 14 个省区，发生面积 5700多万亩（吴立人，个人交流）。 小麦品种与条锈菌的协同进化决定了抗病育种是一项长期的研究工作，国内外许多学者就如何利用小麦品种抗锈性问题提出了许多理论和方法，其中多系品种、聚合育种、及抗性品种的合理布局是在空间上实行抗病基 因的多样化，减小病菌的定向选择压力，控制病菌群体的发展，从而得以延缓或减轻病害的流行；而将具有不同抗病基因类型的品种轮换使用，则从时间上切断病菌的定向选择，控制病菌毒性新小种的发展；利用水平抗性品种，综合应用垂直和水平两类抗性，发挥主效和微效两类基因的作用。这些理论和方法的核心是抗病基因的合理利用，即 实现 抗病基因在时空分布上多元化，使抗病基因和病菌毒性基因互作趋于稳定状态，从而延缓毒性小种产生和发展（牛永春和吴立人， 1997； ， 2004）。 无论采取何种途径，要实现小麦品种抗条锈病基因多样化，必需掌 握丰富的抗病基因明确的抗源。只有了解抗源的基因背景和抗病基因遗传特点，才能对其合理利用。使用抗病基因性质和特点不明确的抗源，会造成品种抗源不同而抗病基因相同的抗病基因单一化。因此广泛收集抗源并对其抗病基因进行鉴别，了解不同抗病基因的遗传特点，有助于合理、有效地利用抗病基因。同时不断发掘和创制新的抗源，扩大与充实抗病基因库，为培育抗病品种提供更加丰富广泛的抗源和抗病基因。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 2 1 抗病遗传研究历史与方法 1905）首次研究了小麦品种对条锈病的抗性遗传，证明其符合孟德尔遗传规律，从而揭开了抗条锈病遗传 研究的序幕。此后，一些学者用实验遗传学方法对小麦抗病性遗传进行了广泛研究，但由于 当时 对作物遗传学和病菌生理小种等还不了解，所以进展缓慢。 1922)首次发现了小麦秆锈菌生理专化现象，并建立了秆锈菌标准鉴别系统，使得通过有性杂交进行遗传分析成为可能，为后来的专化性抗病育种奠定了理论基础。 1955）通过对亚麻 亚麻锈菌的研究，提出了基因对基因假说，为研究寄主和病原物相互作用的遗传学奠定了基础。 1968）根据秆锈菌小种的侵染型推导小麦品种中所含抗秆锈病的基因型，从而 提出根据侵染型推导基因型的设想，之后很多学者都丰富和发展了基因推导分析方法，从而形成了不通过杂交推导寄主和病原物基因型的方法。 1954）培育了中国春（ 全套单体、缺体、三体和四体，利用非整倍体材料可以对小麦抗病基因进行染色体定位，其中单体和缺体分析法可将基因准确定位于染色体上，而端体分析还可将抗病基因定位于染色体臂上。通过非整倍体方法已将很多抗条锈病基因定位在特定的染色体或染色体臂上。二十世纪八十年代以来，分子遗传学等现代生物技术的兴起，使植物抗病基因的遗传分析进入到一个新的阶段。同工酶 标记、染色体原位杂交和 子标记新技术为植物抗病遗传研究提供了更为广阔的前景，分子数量遗传学还可对数量性状基因进行分子标记。 植物抗病遗传研究向宏观和微观两个方向不断深入和发展。常规遗传分析和基因推导分析方法日益发展和完善，使得了解大区域、多品种的抗病基因状况成为可能；非整倍体分析和分子标记等技术的建立和发展，能够在细胞及分子水平上认识抗病基因。各种手段互有短长，互为补充。可以根据试验目的和条件等选择合适的方法。用于抗条锈遗传研究的主要方法有以下 6 种。 因推导分析 基因推导方法就是根据 基因对基因假说，选择一套抗病单基因系或已知基因品种作标准品种，接种一系列已知毒性基因或基因组合的菌系，二者相互作用形成特异性的寄主 较待测品种与标准品种相对应的侵染型组合，推导出其是否具有与标准品种相同的抗病基因或基因组合。 此法周期短，不受生长季节限制，并可在短期内对大量品种进行分析，但易受环境条件和小种鉴别能力强弱等影响。此外，基因间互作、寄主或病原菌小种的杂合性和对照品种复杂的遗传背景也会影响到基因推导的准确性。因而迫切需要建立一套完整可靠的抗条锈单基因系或近等基因系和拥 有更多的具有较强鉴别能力的条锈菌菌系，还需要保持相对稳定的环境条件，以不断提高基因推导的准确性和可靠性，为抗病育种提供更加可靠的信息。 （ 1986）首次用 18 个英国条锈菌菌系对 26 个巴基斯坦小麦品种进行苗期抗条锈病基因推导，发现这些品种中可能含有 基因。 （ 1987）用 18 个生理小种对 17 个捷克斯洛伐克冬小麦品种和 2 个俄国冬小麦品种进行了抗条锈病基因推导，并对其中 9 个捷克斯洛伐克小麦品种进行了成株鉴定，同时指出基因推导只能说明这些品种中可能存在中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 3 的抗病 基因，而不能确定具有这些抗病基因，要得到确切结果还要结合系谱分析及遗传分析等。（ 1989）用英国的 20 个条锈菌菌系和 13 个来自其他国家的条锈菌菌系对 20 个 12 个品种中发现抗条锈基因 4 个品种对所有供试小种表现低侵染型，另外 4 个品种具有成株抗病基因。 （ 1990）用 17 个菌系推导出 11 个印度品种中含有已知抗条锈基因 且根据杂交后代的遗传分析，进一步证实了 存在。 （ 1990）用 9 个法国条锈菌菌系对 21 个法国大面积推广的小麦品种进行抗条锈基因分析，发现大部分品种含 1已知抗条锈基因，在这些品种中推导出的已知抗条锈基因有 （ 1995）用 18 个毒性谱不同的条锈菌菌系对尼泊尔的 38 个野生二粒小麦衍生系和 53 个普通小麦高代品系进行了抗条锈基因推导，并结合系谱分析使基因推导更加可靠，结果发现 28 个野生二粒小麦衍生系对所有菌系表现高抗，在供试小麦品系中检测到 5 个已知抗条锈基因 我国也开展了基因推导研究。杨华安等（ 1990）首次用 20 个国外菌系对我国 23 个小麦条锈菌鉴别寄主的抗条锈基因进行了推导，发现 夫、丹麦 1 号和水源 11 分别含有 夫林 10 和洛夫林 13 含有 蚂 1 号、抗引 655、西北 54 和北京 8 号含有 凤乐等（ 1994a； 1994b）用 20 个国内外菌系对我国的 20 个抗源材料和 39个来自于陕甘川的主要小麦品种进行了抗条锈基因分析，共发现 8 个抗条锈基因 在于这些品种和材料中，并对抗源材料的成株抗性进行了鉴定。张继新等（ 1996）对利用太谷核不育小麦培育出的 13 个京核系小麦品种（系）进行了苗期抗条锈基因推导，结果表明京核 8918811 对所有 20 个供试菌系表现抗病，可能具有新的抗病基因，京核 88 7032 含有未知抗条锈基因，其它 10 个京核系小麦均含有 中京核一号还含有 王凤乐工作的基础上，牛永春等（ 2000）对用于基因推导的国内外菌系进行了筛选和优化，用26 个毒性谱不同的菌系对 50 个河南、山东和安徽的重要小麦品种进 行了抗条锈基因推导，同时还结合品种的系谱分析，发现在所有已知抗条锈基因中 占比例最大，存在于 17 个品种中， 别存在 8 个和 10 个品种中，个别品种还含有 这些结果对了解抗条锈基因在我国小麦品种中的分布和提高抗病育种效率发挥了一定作用。 规杂交分析 常规杂交分析依据孟德尔遗传规律，以抗病品种和感病品种为亲本进行杂交，杂种后代接种单孢菌系，由 过观察杂交 定抗病基因的数量及互作方式，并进行正 反交检测细胞质中是否存在抗病基因。但此法难以准确确定由数量性状控制的抗病基因，但对抗锈性遗传研究，仍有其它方法不可取代的作用。李在峰（ 2003）分析了抗引 655/6*9 与 9 的 现抗引655/6*9 对小种 抗性由一对显性基因控制。赵文生（ 2000）将中国条锈菌鉴别寄主尤皮 2 号与感病品种铭贤 169 杂交、自交和测交，获得 过分析各世代抗性表现和分离情况，发现尤皮 2号至 少含有 4个抗性基因，即 隐性基因控制着对 抗性， 显中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 4 性基因， 补 、 控制对 抗性。 整倍体法 以非整倍体小麦为工具，把抗锈基因准确定位在特定染色体上。其中单体分析、缺体分析可将抗病基因定位于染色体上，端体分析可将其定位于染色体臂上。但这种方法费时、费工，需要一套完整的非整倍体材料，且需熟练掌握染色体分析技术，所以只能用于重 点材料的遗传分析。辛志勇等（ 1994）应用单体遗传分析确定丰抗 13 含有 3 个抗条锈基因，其中位于 2A 染色体上的抗条锈基因为 于 2B 染色体上的可能为新的抗条锈基因，第三个抗病基因没有确定其染色体位置。徐世昌（ 2001）采用单体分析技术研究发现京核 8811 有两个显性抗条锈基因，分别位于2A 和 4D 染色体上。 （ 2005）利用单体和端体将小麦抗条锈基因 位于 6 胞分子遗传学 该方法包括染色体分带技术和原位杂交技术，用来鉴定追踪小麦与亲缘物种的异附加系、代换系和易位系以及导入 普通小麦中的外源染色体或染色体片段。前者属于细胞学方法，后者则属于细胞分子遗传学方法，二者可以互相佐证。与经典遗传学方法相比，这两种方法可以提供关于基因位置更准确的信息。周兖晨（ 2001）以荧光原位杂交技术鉴定了小滨麦品系 93784 的抗条锈病基因位于小麦一对染色体短臂端部的易位片段上。王献平（ 2003）通过基因组原位杂交分析鉴定出两个易位系，一个是小麦的 7D 染色体与 1 条滨麦的染色体发生了整臂易位；另一个是小麦 C 分带证明染色体 3A 和 4A 之间发生了易位。 工酶标记 同工酶标记法是 基于植物基因表达产物酶蛋白图谱建立起来的生化标记法，用染色体上同工酶结构基因表达产物 同工酶为生化标记，根据外源染色体所表达的同工酶特征性谱带，可以鉴定和追踪转移到小麦中的外源染色体（异附加系或端体异附加系）或其片段（易位系）。马渐新（ 1999）对一套小麦 现长穗偃麦草携带新的抗小麦条锈病基因，位于 3E 染色体上，暂命名为 长穗偃麦草编码的酯酶 构基因 2群体共分离， 检测新抗条锈病基因的生化标记。 记 分子标记 是根据广泛存在于不同物种及品种之间 列多态性建立起来的。小麦常用的分子标记包括 。采用分子标记技术可以找到与抗病基因紧密连锁的标记，将抗病基因定位于遗传图谱上。分子标记技术可快速、便捷地检测和追踪到小麦中的抗病基因或远缘杂交中的外源染色体及其片段。其主要优点是：直接以 形式出现，不受环境影响；多态性比较高；表现为中性标记；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；有中国农业科学院博士学位论文 第一章 绪论 5 许多分子标记为共显性。 目前已开发了多种分子标记，依据多态性的检测手段，分子标记可分为：限制性 片段长度多态性（ 随机扩增多态性 扩增片段长度多态性（ 简单重复序列 (抗病基因类似物标记（ 。 制性片段长度多态性（ 最早研究出的分子标记， 1980）首先