【毕业学位论文】（Word原稿）两个水稻粒重基因的遗传分析及定位生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 两个水稻粒重基因的遗传分析及定位 I 摘 要 利用一份优异的水稻大粒品种宝大粒（谷粒较大且重，遗传稳定）与中花 11杂交，构建了宝大粒 /中花 11 的遗传定位群体，由于粒重是一个复杂的数量性状，在 群体中采用了极端取样的方法进行基因的初步定位分析，经初步定位，在水稻第 3 和 6 染色体上定位到 2 个粒重基因，分别将其命名为 于染色体区域与已有的关于粒重精细定位和克隆的报道结果一致 ， 所以我们的研究重点是 在初步定位的基础上，进一步构建精细定位群体，包括 体及 近等基因系群体 ， 体主要用于验证谷粒长圆性与两个粒重基因的相关性，同时对 行进一步的精细定位， 近等基因系的构建主要是利用中花 11 作为轮回亲本，采用回交和分子标记辅助选择的方法来构建。同时选取了另一份水稻大粒品种服务浙江 1 号，通过田间杂交和后代群体的连锁验证来进行等位性检测，获得的主要结果 如下： 1. 粒表型正常，没有出现大粒性状，表明控制粒重的基因是隐性的， 离群体中性状出现连续变异现象，表现出数量性状的特点。 2. 在 群体中利用极端取样的方法对粒重基因进行初步定位， 通过实验发现在两个位点处分别出现连锁现象，一个位于第三染色体的 记 间，两标记相距 7.3 一个位于第六染色体的 记 间，两标记相距 别命名为 3. 利用 体对 长圆 性 与两个粒重基因（ 相关性进行验证，主要是利用 与 两 个 基 因 分 别 连 锁 的 分 子 标 记 （ 第 三 染 色 体 的 记 第六染色体的 记 进行连锁分析 ，分析结果表明水稻第三染色体的粒重基因 制长粒 （粒长） 性状，第六染色体上的粒重基因 制圆粒 （粒宽） 性状。 4. 利用 体对 行进一步的定位，将 定在分子标记 间的 4.7 范围内。 5. 为了进一步精细定位 建了 近等 基因系，目前构建到 。 6. 利用服务浙江 1 号进行等位性检测，与宝大粒的杂交 时利用已经定位的连锁分子标记对服务浙江 1 号与中花 11 的 体进行检测，检测结果发现这些分子标记在此群体中也表现出连锁，进一步证明了服务浙江 1 号具有和宝大粒等位的粒重基因。 关键词 ： 水稻 ， 粒重 ， 基因定位 ， 分子标记辅助选择（ n in it is a 8.8 g/1 to 2 3 We we of we we 2、 F3 In to or or s 3 by of In to of to of 55 669 F3 of by At to 1 is by in 2 it is by 2 to gw at a 7.5 cM SR s 55.8 63.3 on , on a 28.8 cM SR 54.1 82.9 on . to or 669 F3 of of at a 4.7 cM re 73.2 on . to 2 is as So we 1, 2 2 d w 录 英文缩略表 . 1 第一章 文献综述 . 2 言 . 2 稻大粒种质资源及其遗传与分子生物学研究进展 . 2 粒种质资 源 . 2 重的经典遗传学分析 . 3 定位的粒重的 精细定位的粒重基因及相关基因 . 5 重基因的分子育种 . 11 稻基因的图位克隆 . 12 位克隆的技术环节 . 13 位克隆技术在水稻中 的应用 . 15 量性状的图位克隆 . 15 研究的意义和基础 . 16 第二章 水稻粒重突变体的鉴定，遗传分析及基因 的精细定位 . 18 验材料和方法 . 18 物材料 . 18 间杂交及群体的构建 . 18 用分子生物学试剂 . 18 验方法 . 19 果与分析 . 23 稻粒重突变体的遗传分析 . 23 因的初步定位 . 24 因的精细定位 . 26 份突变体的等位性检测 . 27 第三章 全文结论与讨论 . 28 论 . 28 重基因的定位 . 28 粒长圆性与两个粒重基因的关系 . 28 位性检测 . 28 论 . 29 位克隆策略的应用 . 29 因定位干扰因素的排除 . 29 已定位的其它粒重基因或 比较 . 30 位性检测 . 31 望 . 31 V 参考文献 . 34 致 谢 . 39 作者简历 . 40 - 1 - 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 量性状位点 倍单倍体 组自交系 等基因系 增片段长度多态性 制性片段长度多态性 机扩增多态性 单序列重复标记 列标签位点 切扩增序列多态性 达序列标签 菌人工染色体 母人工 染色体 1质粒人工染色体 合酶链式反应 子标记辅助选择 bp 基对 摩 溴化十六烷三甲基铵 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 2 - 第一章 文献综述 言 谷粒重量是产量构成三要素之一，一般以千粒 重表示。在育种利用时，由于粒重与粒长、宽与厚之间呈正相关，粒重性状有时以粒长、宽与厚的综合指标衡量。同时，粒重或谷粒大小也是一个极为重要的品质性状，一般细长的籼米受多数人喜欢。此外，粒重在禾谷类作物进化上也具有重要的意义，由于小粒种子生活力较低、机械收获难度大，人们在水稻驯化过程中趋向于选择大粒的品种进行栽培，逐步形成了籽粒偏大的栽培种。而粒重和粒长都是高度遗传的，有利于遗传分析（ 998）。所以，理解粒重遗传和分子基础有利于水稻育种改良。 目前水稻基因定位的方法有很多，其中图位克隆策略 最为 常见 ，利用图位克隆策略已经定位并克隆到了许多水稻基因，如 。除了这些质量性状基因，数量性状基因的图位克隆也取得了一定的进展 ，如 。 本章将对水稻大粒种质资源及其遗传与分子生物学研究进展，水稻基因的图位克隆和数量性状基因的图位克隆几个方面分别进行阐述。 稻大粒种质资源及其遗传与分子生物学研究进展 粒种质资源 大粒资源在世界各国分布广泛，国际水稻所遗传资源中千粒重高的资源主要集中在 48 个国家和地区，以老挝、菲律宾、泰国、印尼和印度为主， 在 905 份大粒材料中，籼型 396 份，占 粳稻 82 份，占 爪哇型 387 份，占 杂交后代 40 份，占 籼型和爪哇型主要来自亚洲国家。粳型以巴西、意大利居多。千粒重超过 45 克的仅 18 个品种，老挝 8 个，印度 5 个，泰国 5 个。超过 40 克 的材料，泰国和老挝最多， 杂交后代的大粒资源也主要集中在老挝和泰国， 53 份大粒杂交后代中，老挝的就有 37 份，这些大粒资源均可供育种学家 利 用。我国也具有非常丰富的水稻种质资源，在七五工作的基础上筛选出的 2000 多份优异种质中，千粒重 20 克以上的大粒种质有 108 份。八五在杭州进一步进行筛选并评价，评出综合性状较优的大粒种质 7 份，可为育种和生产利用（ 郭龙彪等， 1995） 。 按千粒重分类，在 108 份中，在 30的品种有 66 份， 35的 33 份，40 克以上的 9 份。千粒重从大到小排在前八为的有日本的 浙江的宝大粒（ 湖北的特大粘（ 日本的 湖北的二粒寸（ 浙江的三粒寸（ 江苏的 90浙江的竹云糯（ 湖北的特大粒（ 按品种类型分，其中陆稻 12 份，占 籼稻 24 份，粳稻 84 份。若按丁颖的系统分类法，大粒种质可分 16 个类型。按性状分类，其中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 3 - 中矮秆 38 份，大穗 42 份，抗病虫害 8 份，抗逆性 20 份，优质 1 份，香米 4 份，紫米 1 份，综合性状优良的 7 份（表 这些丰富的大粒遗传资源为作物育种和遗传研究提供广阔的遗传基础。从丰富的水稻资源中 ,筛选出更多的特异水稻种质仍是今后水稻种质研究的重要内容。随着粳稻基因测序工作的完成 ,发掘和分析基因的结构和功能的能力日益强大 ,对水稻种质 进行分子遗传研究 ,克隆、分离水稻重要基因 ,将使水稻育种进入一个更新领域。 表 粒 重排 名 前九 位的 水 稻 品种 9 w g 品 种 名 称 产地 千 粒 重 （ g） 日本 大 粒 浙江 大 粘 湖北 日本 粒 寸 湖北 粒 寸 浙江 0苏 云 糯 浙江 大 粒 湖北 合 性状 较 优的 大粒 种 质 资源 Ex m of e 品 种 名 称 统 一 编 号 来源 主 要 性 状 特 点 北路 129 本 中 粳 、 大 粒 白 腰 线 04西 早 籼 、 早 熟 903苏 中 粳 、 抗 倒 老 酒 稻 24西 粳 中 水 糯 、大 穗 、高 产 老 芒 稻 陕西 大穗 硬 水 稻 24 陕西 粳 中 水 糯 九 月 黄 24西 粳 中 水 糯 、 高 产 注： 统一编号为国家统一编号。 重的经典遗传学分析 有关粒重的经典遗传学分析起步较早，相关研究较多，研究的也较为深入。1 粒重为多基因控制的数量性状 粒重是与作物产量有关的重要性状。大多数的研究结果表明与产量有关的大部分性状均 为数量 性状。熊振民 等 1972年开始在育种 工作的 同时观察广陆 矮 4中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 4 - 号、青马早、原丰早等 14个亲本、 18个组合后代粒重的遗传动态。实验结果和前人研究相似。证明粒重是一个多基因控制的数量性状，在杂交第二代里出现了连续性的变异。 1964）的研究结果表明大约有 10对基因控制粒重性 状。 祁祖白等 （ 1983） ,芮重庆等 （ 1983） , 1983） ,1989） ,石春海等 (1995)的研究结果也均表明粒重是受多基因控制的数量性状， 而刘晓辉（ 1989） 用 4个千粒重的 4个亲本，配成 4 4全互交组合，认为千粒重是较复杂的数量性状，并且在亲本中控制该性状的等位基因分布是不均衡的，千粒重是由主效基因和一些分布不均衡的微效多基因同作用。 2 粒重的遗传力高 熊振民等（ 1976）对 9个籼稻组合的进行研究，根据杂种第二代的表现，对控制水稻各经济性状进行了广义遗传力分析，研究结果 表明，各经济性状的遗传力，生育期 粒重 株高 穗长 粒数。粒重的平均遗传力可达 各组合间也较一致。在此之前沈锦骅 （ 1963） 估算的广义遗传率为 不同外观品质性状的遗传力差异较大，其次序为千粒重 长宽比 粒长 粒宽 垩白率 垩白面积。 粒重也具有较高的狭义遗传率。熊振民等 19731中同一单株的后代 分别选取大粒和小粒，而后连续观察到 果在两个组合的 28对单株的比较中，证明粒重这个性状，遗传力是很强的，选择效果亦显著，在 3间的相关系数可达 +，极显著相关 。芮重庆等 （ 1983） 估算的狭义遗传率也高达 符 福 鸿 等 （ 1994） 的 研 究 结 果 认 为 遗 传 力 可 达 李仕贵等（ 1995）的研究结果认为千粒重的狭义遗传力为 据庄巧生等（ 1962）研究，遗传力高而遗传变异又大的性状在一定选择率下遗传进度较大，早期世代选择也有效。因此对粒重早代选择效果较好 。 3 粒重的加性显性效应 在 遗 传 环 境 中 , 一 般 认 为 粒 重 是 受 多 基 因 的 加 性 效 应 所 控 制 。 但 . 1986） 则认为以显性效应为主 ;而 1983） 等认为加性和显性 均很重要。周清元等 （ 2000） 的研究结果表明粒重除受制于基因的加性效应外 ,更多受制于非加性效应 1995） ,芮重庆 （ 1983） ,符福鸿 （ 1994） 的研究结果有一定差异 ,但石春海 （ 1995） 研究结果中可以看到 ,在不同的杂交组合后代中 ,不同组合受制于加性和非加性效应不同 ,所以可以认为差异主要是由组合不同所引起的 显性效应值为负值，在显性度上为超显性 ,粒重的加性效应在遗传效应中占的比重不如显性效应大 。 4 粒重的超亲遗传 1974） ,熊振民 （ 1976） 认为无论“大粒大粒”、“大粒小粒”或“小粒小粒” ,都可能获得大粒型品种 ,特别是不同类型之间杂交后代 ,很容易出现超亲遗传 ,但周傲南等 （ 1964） 的研究结果却未发生超亲现象。桂树勋等 （ 1984）的研究结果亦证实粒重超亲是存在的。符福鸿等 （ 1994） 利用 30 个杂交组合对粒长 、 宽 、 长 /宽 和千粒重进行研究，结果除在粒宽性状上没有一个组合表现出显著的超亲优势效应外，在其他 3 个性状上均有超亲优势效应的组合出现，其中千中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 5 - 粒重表现为超亲优势的组合最多，有 11 个。石春海等 （ 1995） 利用 3 个杂交组合研究粒型的遗传时发 现各组合 出现超亲现象，约超过高亲值的 李仕贵等 （ 1995） 利用 6 个不育系和恢复系按不完全双列杂交组配的材料，通过研究发现千粒重的 高亲为负值，超中亲和低亲均为正值，表明他们的 优势居于双亲之间而偏向高值亲本。在超高产组合中，桂树勋等 （ 1983） 认为千粒重超亲原因之一是谷粒长、宽、厚性状的基因累加的结果。 5 粒重的母性遗传 水稻谷粒重是对属于母体组织的颖壳进行度量，其遗传表达完全取决于母体植株的基因型， 有的研究认为粒重性状上存在着母本影响或一 定程度的非等位基因的相互作用。 从遗传学上讲，生长在母体植株上的水稻籽粒是由雌雄配子受精发育而来的新世代个体，母体植株对籽粒不仅贡献了部分遗传物质，还提供了大部或全部营养物质。由于籽粒的营养物质由母株所提供，有些籽粒性状的表现可能会同时受到籽粒核基因和母株核基因两套遗传系统的控制。另外细胞质基因也可能通过控制叶绿体 （ 或线粒体 ） 的合成而影响植株的光合 （ 呼吸 ） 作用，从而间接控制籽粒性状的表现。正是由于这一原因使得籽粒这一复合体的遗传显得较为复杂。多数研究者认为水稻籽粒性状主要受母株基因型控制 ；而 符福鸿等 （ 1994）研究粒重 性 状同时受父母本的影响，而且其影响均达显著水平。 6 粒重与谷粒形态特征的关系 在粒形性状的相互关系上， 1979）证明 粒重与粒长粒宽间关系密切；石春海等 （ 1995）证明 粒长与粒重间呈显著或极显著正相关， 1983）进行双列杂交分析后发现粒长与粒重为正相关 ,粒厚与粒重表现为正相关。芮重庆（ 1983） 等认为粒长、粒宽和粒厚 3 个粒形性状对粒重的总影响力占 粒长对粒重的影响大于粒宽和粒厚 ， 粒厚与粒重的相关最为密切。而符福鸿等 （ 1994）认为粒宽与千粒重成极显著正相关，千粒 重与长 /宽之间均成极显著负相关；但王余龙等 （ 1995） 则认为粒重与谷粒厚度关系密切，与谷粒的长度、宽度关系不密切。李仕贵等 （ 1995） 的相关分析表明，长宽比与粒长和千粒重，粒长与千粒重均呈极显著正相关。 定位的粒重的 精细定位的粒重基因及相关基因 1 已定位的粒重基因 随着分子标记技术的发展和应用，粒重的 位已有许多相关报道。 至少有 12 个水稻的遗传群体用于 位和定位的粒重 89 个，分布于水稻的所有 12 条染色体上。徐建龙等 （ 2002） 应用 292 个 青的重组自 交系（ 检测到影响千粒重的 11 个 别位于第 1、 2、 3、 4、 5、 10 和 12染色体上，联合贡献率为 林荔辉和吴为人 （ 2003） 利用以两个籼稻品种 亲本杂交建立的重组自交系群体检测到 16 个与粒重有关的中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 6 - 解释 表型变异，分布在 8 条不同的染色体上，其中有 5 个分布在第 3 染色体上。另外有许多研究利用不同的群体在第 3 染色体上检测到粒重 : 9024/22 群体 （ et 1995， 1996）； 7/ 3 群体 （ Yu et 1997； et 2001, 2002； et 2005）； /7 群体（ Lu et 1996）； 体 （ Li et Xu et 2002） ；体 （ et 1998） ; 体 （ a 998） ； 体 （ 001）； O. 体 （ et 2001） ; 群体 （ et 2002） ; . 体 （ et 2003）； et ， 2003）； 体 （ 004） 等。其中美国康乃尔大学选用热带粳稻 品种为轮回亲本，与普通野生稻材料配制组合，构建了 353 个株系组成的 2 群体，在千粒重性状上检测到 8 个 中位于水稻第 3染色体的近中心粒区间的 现最稳定，贡献率也较高，再此基础上 选用该区间开展了千粒重 精细定位研究，利用表型极端法和多代回交构建的近等基因系，最终将 位于 区间。 et 1996）、 Li et 1997）、郭龙彪等（ 2003， 2005）和 2003）等利用不同的遗传群体也将一个粒重 位在第 6 染色体上。 本课题组利用一优异的大粒种质宝大粒（子粒较大且重，遗传稳定）与中花11 杂交，构建了宝大粒 /中花 11 的遗传群体，根据已公布的水稻 记利用 行了连锁分析，并初步定位到 2 个粒重基因，分别位于第 6 染色体的 记 间和 3 染色体 记 间（ 由于 染色体区域与前面报道的结果一致；所以，我们的研究重点是 通过大粒和该区域的分子标记选择建立 了 传群体。表 出了部分与粒重相关的 表 粒重 相关 of g w 定 位 群 体 检 测 到 的 粒 重目 染 色 体 参 考 文 献 o f 3 8 1（ 2）， 3， 5（ 2），6， 7， 9 et ， 2005 DH o f 2 1， 4 et 1995 F 1 o f (9024/22) F 7 / /9024 5 3， 4， 5， 7， 8 et 1995 F 8 o f 3 3， 4， 5 et 1996 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 7 - 9024/22 F 2 o f ， 4， 5 et 1996 ， 10 et 1996 F 2 ： 4 o f g 9 1， 2（ 2）， 3（ 3），5， 6， 10 Li et 1997 DH o f g 8 /7 a*b *c*1， 2， 5， 6， 8 1， 2， 3， 6 1， 2， 8 Lu et 1997 F 13 o f g 11 1， 2， 3， 4， 5， 10， 12 Xu et ， 2002 o f 6 1， 3（ 5）， 4,5 7(2),8(2),9,10(3) et ， 2003 IL 1 1 （ 2 ）， 3 （ 3 ）， 5（ 2 ）， 6 ， 7 ， 9 ，11 et ， 2003 注： * 该 群 体 各 株 系 同 时 种 植 于 三 个 环 境 ,以 、 、 代 表 。 2 精细定位的粒重基因及粒重相关基因 1） 精细定位的粒重基因 国康乃尔大学选用热带粳稻品种 轮回亲本 ,与普通野生稻材料组合 ,构建了有 353 个株系组成的 2 群体 ,采用多点实验鉴定稻谷产量、产量构成因子、生育期和一系列形态性状 ,应用一个有 153 个 记组成的连锁图检测控制这些性状的 千粒重性状上检测到 8 个中位于水稻第三号染色体的近中心粒区间的 现最稳定，贡献率也较高。而且，在其他一系列的水稻亚中内、亚种间和种间组合中， 属区间都表现出对粒重或粒长遗传控制的重要性。 Li et 2004）选用该区间开展千粒重 精细定位研究。首先 ,从 到一个株系，该株系的粒重显著低于其他株系，在 间携带一个长度为 生稻片段，而遗传背景趋于栽培稻亲本 用该株系与 别 回 交 一 和 两 次 ,进 一 步 剔 除 非 目 标 区 间 的 野 生 稻 背 景 ， 构 建 了 体，再从中选出一个 两个 系 ,经自交和回交后建立 体。在 群体中利用两个互补的策略鉴定可以提供信息的重组体，利用正向遗传学方法，表型分布的极限值被基因定位在目标区域的标记位点。同时比较 两组的单模标本来鉴定可以提供信息的重组断裂位点。表型极端值的利用可以避免在早代分析时环境变异和遗传背景的影中国农业科学院硕士学位论文 第一章 文献综述 - 8 - 响。通过反向遗传学的方法，利用在目标区域的标记来定位群体，把群体分为 3个基因型组，然后在 等基因系的 比较这些基因型组的表型平均值来决定典型的重组断裂位点。从 1920 个 株中选出 173 个重组型号个体，测定千粒重，所检测到的千粒重 高 与原群体定位结果一致，但 从原来的 至 献率由 至 进一步应用衍 生的 532 个 株测定千粒重和粒长 ,所检测到的千粒重 粒长高 处与位置一致，但对群体千粒重表型变异的贡献率升到 为 ，对粒长表型变异的贡献率高达 为 。进一步选用具有极端表型的样本分组 ,结合交叉重组染色体片段分析法，并增加目标区间的标记，最终将 位于 区间中。具体的技术路线如图 引自 2004） 图 展 和 精 细定位 的 的