【毕业学位论文】（Word原稿）猪带绦虫六钩蚴45W-4B和TSO18重组基因工程疫苗的研究预防兽医学博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 博士学位论文 猪带绦虫六钩蚴 45 组基因工程疫苗的研究 of on 5of of of 5 猪带绦虫六钩蚴 45 组基因工程疫苗的研究 摘要 囊虫病（ 由猪 带绦虫（ 幼虫猪囊尾蚴寄生于人或猪等中间宿主而引起的人畜共患寄生虫病，在中国大部分地区尤其在少数民族地区是一个重要的公共卫生问题，对人的健康危害很大。不仅如此，囊虫病的广泛存在还造成畜牧业的重大经济损失，极大影响了我国畜产品在国际市场上的竞争力，因而是公认的社会经济病之一。猪囊尾蚴病的免疫预防之所以一直困扰着兽医工作者，主要原因是抗原来源非常有限。羊绦虫 45W 重组基因工程疫苗的研制成功，为猪囊尾蚴重组基因工程疫苗的研制提供了典范。为了探索猪带绦虫 45 组抗原对 猪囊尾蚴感染的免疫保护效果，获得具有良好免疫保护作用的重组抗原，用做猪囊虫病的免疫预防，我们进行了本项研究。 收集成熟的猪带绦虫虫卵，经孵化和激活后，提取六钩蚴总 设计特异性引物增 45 因，测序证实扩增产物与国外克隆的猪带绦虫 45同源性分别为 说明 45不同虫株间相对保守。用蛋白质专家系统对 5行结构预测，发现它们都有分泌信号序列、 酸化位点。根据预测结 果 增 截 去 45因的 N 端信号肽和 得 45 5制性内切酶处理 后与相同处理的表达载体 化 切及 测序证明阅读框完全正确，用 物进行 现在合适的诱导温度和 度下，分别获得了高效表达且以可溶性形式存在的 45是人囊虫阳性血清均可被两种重组蛋白所识别。 分别用纯化的 45 206 为佐剂制成疫苗免疫猪，用 25000枚猪带绦虫虫卵攻击感染， 时用 分析免疫和感染后猪外周血淋巴细胞增殖情况。结果表明，免疫后15感染后 30至少在免疫后 90免疫后外周血淋巴细胞略有增殖，而在感染后 1021染后 90数各组的 囊尾蚴感染数，结果发现 55%和 94%，与猪囊尾蚴粗抗原免疫组（减虫率为 92%） 的保护效果相当。而 疫组的减虫率为 完全保护率达 80%，保护效果明显优于粗抗原对照组。 在补体参与下， 5钩蚴的存活率分别从 90%和 85%下降到 55%和 70%。 P= 此推测 免疫应答过程中作用可能较小。用5W 不等， 在所有的样品中 显示为次要的亚型，如果忽略质粒本身的作用，上述结果仍然能够很好的重复（ et 995） 。早期研究表明 ， 此推断45本研究所做的补体依赖实验也证明，在补体参与下， P=而 45体无论是否存在补体，其对六钩蚴的杀伤作用差异不大。这一结果似乎也证明， 45要中国农业科学院博士学位论文 第五章 重组抗原的免疫机理和保护性研究 69 补体参与。 清抗体增长曲线分析 猪第一次免疫后 15倍以上，二免以 后 20加强免疫外，另一个原因是攻击感染所致。因为攻虫后 14d 血清中已出现六钩蚴抗体。（ 1996）研究认为猪带绦虫中绦期抗原含有与成虫和六钩蚴阶段抗血清交叉反应的表位，而六钩蚴却含有大量阶段特异性抗体。 血清中的六钩蚴特异性抗体在感染后一个月即可检测到，而囊尾蚴阶段的抗体到感染后第 3政用猪囊尾蚴匀浆抗原配以佐剂对猪免疫两次，用妊娠节片攻击，总保 护率达 100%，接种 105% 48d 抗体滴度达到峰值，并可维持 164们所得的结果与上述结果基本一致，抗体水平在免疫后 1545且可保持抗体阳性达 4个月左右。但本实验我们在感染后一个月开始用粗制囊尾蚴抗原检测抗体，抗体水平均表现低水平，三个月时的 体负荷与囊尾蚴抗体之间无相关性，即猪体的囊尾蚴数量多而囊尾蚴抗体却不高。原因之一可能是囊尾蚴抗体在感染 3性较低，检测循环抗原的方法相对比较敏感，理论上可检测出一个或几个虫体。另一原因可能是只有感染的囊尾蚴达到一定数量，抗体水平与囊尾蚴数才存在一定的相关性。 2003）以 103、104、 105剂量的猪带绦虫虫卵分别感染三组小猪，用单抗检测血清中的循环抗体，发现在感染后 2有活囊虫的猪仅在短期内可检测到，当囊尾蚴钙化后 此我们认为本研究囊尾蚴抗体的水平普遍较低，可能与 虫体寄生数量太少和虫体的发育程度不同以及检测方法的敏感性都有关系。 照组免疫结果分析 启动子，与日本血吸虫的 谷胱甘肽 合的可用乳糖类似物诱导的高水平表达载体。 1999）研究了猪带绦虫谷胱甘肽 S 转移酶，发现其活性与哺乳动物 近，分子量为 26且 白存在于猪囊尾蚴的体壁、实质组织（ 原肾管（ 外皮的神经细胞体中，用猪带绦虫 疫小鼠可降低中绦期虫体负荷达 析显示猪带绦虫 带绦虫、鼠巨颈绦虫等发生交叉反应，而与曼氏血吸虫、鼠、兔以及猪肝组织的 明血吸虫 虫发生交叉反应，而与猪带绦虫和哺乳动物组织中的 以 刺激宿主产生很高的抗体滴度，但该抗体不能识别猪带绦虫的 而对猪带绦虫感染没有保护性，所以 于该组的虫体数高于未免疫对照组，可能主要是这两组猪属于不同的来源，存在年龄、遗传背景和个体方面的差异造成的。 中国农业科学院博士学位论文 第五章 重组抗原的免疫机理和保护性研究 70 组抗原的免疫保护性分析 从剖检结果可以看出，重组抗原免疫组的减虫率都在 67%以上，而无论是 45独免疫的减虫率都在 94%，与粗制抗原免疫组的减虫率相当。而且 4保护率也达到 80%。说明 45它几组减虫率降低，主要原因可能与补充免疫猪的虫体负荷普遍都偏高有关。而且未免疫对照组的感染率不高，也是导致减虫率低的主要原因。本实验加有 粒的免疫组，除 4疫组外未出现预期的免疫增强作用， 有些组反而减虫率有所降低。一是可能基因免疫受很多因素的影响，如质粒的纯度、免疫的方式及所用的佐剂等；二是猪个体之间的差异所致，因为即使同一免疫组猪的虫体负荷可以从零到几十不等；但最重要的原因可能是补充免疫猪在各组中的分布不平衡造成的。从各组虫体计数的结果可以看出，在和 33，而减虫率为 95%和 89%。而在4和 50，两组的减虫率分别为 94%和 83%。所以这两组的减虫率较未加 而其免疫水平最好，保护率也最高。 （ 2003）用合成的三肽（ 疫猪，发现外周血单核细胞合成的 细胞因子（ 剧增加，并且导致感染早期严重的局部炎症反应。说明该疫苗的保护效果是以细胞免疫为主。 张唯哲 等（ 1997） 应用四甲基偶氮唑盐（ 检测了 31例未经治疗的囊虫病患者外周血单个核细胞 （ 产生 平，同时用 30 例健康人作对照。实验结果显示，囊虫病 患者 平明显低于正常人（ P而患者血清中 平明显高于正常人（ P本实验提示囊虫病患者外周血中低水平的 能与患者细胞免疫功能低下有关 ，说明囊虫病患者产生的免疫应答以体液免疫为主 。 （ 2003）研究了小鼠接种猪带绦虫中绦期抗原后 取免疫和对照鼠的脾细胞 现中绦期抗原能诱导 时能诱导产生嗜酸性细胞和特异性 其 是 内产生的免疫应答和体外细胞因子的产生具有很好的相关性，说明中绦期抗原诱导的免疫应答系 合性，但以体液免疫为主。从我们的结果分析，第一次免疫后淋巴细胞的增殖不太明显，加强免疫后才出现明显增殖。而攻击感染后淋巴细胞增殖非常明显，说明初期阶段重组抗原所致的免疫应答以细胞免疫为主。而感染时的抗体水平统计分析发现，抗体水平的高低与最后的减虫率密切相关。再者免疫血清对六钩蚴的杀伤是补体介导的抗体作用，至少说明抗体在保护宿主免受感染方面起重要作用。一些研究也认为，囊尾蚴感染早期的宿主 免疫应答以体液免疫为主，而感染后期细胞免疫才被启动。 尽管入侵的幼虫能被免疫血清和补体杀死，但包囊阶段的免疫却依赖于细胞免疫。 所以要搞清两种抗原到底是以细胞免疫还是以体液免疫为主，需要检测外周血淋巴细胞在抗原刺激下，表达细胞因子的类型。或鉴定出免疫血清中的 中国农业科学院博士学位论文 第五章 重组抗原的免疫机理和保护性研究 71 从本实验可以看出，影响猪囊尾蚴基因工程疫苗免疫效果的因素很多，往往导致出现意想不到的结果。本实验两种重组抗原单独免疫的减虫率都较高，与粗抗原免疫组相当。而添加 。其原因可能是： 1. 感染时虫卵的活力，因为猪带绦虫的虫卵只能通过显微镜检查才能对其活力进行定性分析，而不可能像病毒和细菌一样进行定量测定，只能通过感染动物剖检囊尾蚴的数目才能真正知道虫卵的感染力； 口服含一定虫卵的生理盐水溶液 ,不能保证猪在吞咽的时虫卵完全进入猪胃内，使感染的虫卵数产生误差，导致个体间的虫体负荷差异较大； 疫苗免疫后抗体水平达到峰值时进行攻击感染，此时获得的保护性应当是最好的。 然而由于猪带绦虫虫卵获得比较困难，而且保存时间不能过长。所 以抗体达到峰值需要感染的时候往往不能及时获得虫卵。而在免疫工作尚未做好，抗体水平尚未完全升高时，又获得虫卵需要尽快感染，往往使研究处在事与愿违的尴尬境地；本实验尽管按正常的免疫程序设计，即在加强免疫后 3由于虫卵提前获得，所以攻击感染在二免后 7d 进行，此时二免时补充的猪抗体水平还很低，所以导致这些猪的虫体负荷偏高。 于不同的个体具有不同的遗传背景、不同的性别、不同的健康状态，导致同一组不同个体间虫体负荷差异较大，即使对照组也会出现几个到几百的 虫体差异。 且完成需要很长时间，当结果不太理想时进行多次重复不太现实。因为猪囊虫感染后至少要在 70d 后才能知道免疫的效果，如果要进行几批实验，而且每次都按正常的免疫程序进行，一次动物实验的时间几乎在半年左右，所以一年内只能重复一次。 生物应有所区别。微生物免疫保护的效果是以动物是否发病为标准，即使它有一定量的微生物感染，但并不表现临床症状，则视为具有免疫保护性。而寄生虫疫苗尽管获得了 99%的减虫率，但毕竟还有 1%的虫体感染，所以按照现有 的标准，仍然视为保护性为零。目前一些学者已经建议将减虫率等同于保护率，使寄生虫疫苗的质量判定更加标准化、更加客观。 本实验的免疫猪虽然完全保护率低，但仍然可作为疫苗抗原应用。因为即使疫苗的减虫率在 50%，免疫接种后也会大大降低囊尾蚴发育成绦虫的数量，从而降低猪囊尾蚴病的流行。在新西兰羊囊尾蚴的自然感染率在 13%，田间实验接种羊 45低到 感染率降低了 83%。 根据巨颈绦虫蛋白序列合成三种多肽疫苗 p，三种多肽已在小鼠 证明能诱导保护同源攻击感染，且被证明能作为疫苗抵抗猪带绦虫，降低虫体负荷达 50%。为进一步验证该多肽疫苗的田间免疫效果，免疫猪 120头，另设未免疫猪 120 头（该地区猪囊虫的自然感染率为 14%）作为对照， 10月后剖检， 120 头免疫猪共检出 1369 个囊虫，而 120 头对照猪共检出 66565 个囊虫，免疫后囊虫的总数减少了 降低囊虫流行 中国农业科学院博士学位论文 第六章 重组蛋白的稳定性分析 72 第六章 重组蛋白的稳定性分析 摘要： 重组蛋白的稳定性对于一种疫苗抗原而言是非常重要的，即使抗原的免疫保护效果再好，如果不能贮存一定的时间或经过一定时间大部分 已降解，那应用起来也是很不方便。45然都是经大肠杆菌表达系统表达并纯化得到的，但由于二者间系不同的蛋白分子，而且也经过了不同的修饰，因此这两种表达产物的活性和稳定性可能存在一定差异。将纯化重组蛋白 5 放置 90d，然后免疫家猪，测定不同时间抗体的增长动态，并在二免后 4570计算各组的减虫率，比较重组抗原减虫率的变化。分别取保存后 1 个月、 2个月的重组蛋白进行 蛋白浓度测定，分析 重组蛋白的稳定性。动物实验结果表明， 45疫组的减虫率达到 97%，完全保护率为 60%，免疫保护效果基本没有发生变化。而 疫组的减虫率从保存前的 95%下降到 降低了 蛋白浓度和析结果表明 原很不稳定，保存 2 个月后 2/3 已降解，所以 组蛋白最好在 15重组 45少可以在 4 保存 3 个月以上。 关键词 ： 45虫率；含量检测；保存期 1 材料和方法 剂和动物 剂 脱氧胆酸钠（ 、十二烷基肌氨酸钠（ 溶菌酶、尿素购自上海生工生物工程公司、 06佐剂、猪囊尾蚴粗制抗原、猪囊虫阳性血清、胰酶、盐酸胍、邻苯二氨（ 由本实验室保存。 囊尾蚴检测试剂盒由本室研制。 液的配制 10 l( 1 :5050油， 硫苏糖醇。 10 2710118于 950 加水至 1000 10胱甘肽洗脱缓冲液： 原性谷胱苷肽溶解于 50脱缓冲液 50 高 低 酸钠 中国农业科学院博士学位论文 第六章 重组蛋白的稳定性分析 73 包被液（ 蒸馏水至 1000 4 保存。 底物溶液（ ：磷酸盐柠檬酸缓冲液 100苯二胺（ 4030%鲜配制。 洗涤液（ ： 8g 2溶于 950 水至 100020。 磷酸盐柠檬酸缓冲液（ )檬酸（ ） 馏水 50 终止液（ 22浓硫酸 馏水 实验动物 18头 10按常规的饲养和管理方式进行饲喂。 验方法 组抗原的免疫保护实验 组抗原的制 备及纯化 按第五章 苗的制备及免疫 将重组抗原置于 4 冰箱 3 个月后，分别与 206 佐剂乳化制成疫苗。实验猪随机分成 3组： 45疫组、未免疫感染对照组，每组 6 头。每头猪于颈部肌肉注射 300 15免疫感染对照组不做任何免疫。 验动物的攻击感染 剪取猪带绦虫的新鲜成熟节片，生理盐水冲洗数次后，置平皿中用眼科剪刀剪碎节片，并挤压使虫卵完全释放出来，用显微镜观察虫卵的活力，计数结构完整 和形态清楚的虫卵，然后计算每毫升中所含的虫卵数，用生理盐水将虫卵稀释至 10000 枚 /第二次免疫后45d，用注射器吸取 卵液，撬开猪嘴，将注射器伸进猪口腔内，轻轻将虫卵液注入猪舌根部，待猪将虫卵液吞入胃内，大约半小时后再进行饮水或饲喂。 验猪血清抗体的检测 分别在免疫前和免疫后每隔 15d，在前腔静脉丛采血 37 温箱 1 4放置几小时， 3500r/10心分离血清。将 纯化的 45 原，用包被液（ 稀释 至 50 g/孔加入 100 所述中国农业科学院博士学位论文 第六章 重组蛋白的稳定性分析 74 方法进行间接 苗的免疫保护性分析 三组实验猪于感染虫卵 70d 后采血剖杀，仔细检查猪体全身的囊尾蚴感染情况，并分别计数干酪样和水泡样虫体，以及每头猪总的囊尾蚴感染数。与对照组的虫体进行比较，计算各免疫组的减虫率，评价两种抗原保存 3个月后的免疫效果。 组抗原稳定性的定性定量分析 将通过 纯化的 45溶性蛋白和用 纯化的 涵体蛋白进行酸、 蛋白检测仪分别测定 算其含量后放在 4 冰箱。分别在 1个月和 2个月后吸取少量进行 蛋白的浓度变化进行定性分析。并用核酸、蛋白检测仪测定其含量，比较分析纯化蛋白在 4 的稳定性。 中国农业科学院博士学位论文 第六章 重组蛋白的稳定性分析 75 2 结果 组蛋白的免疫实验 体水平的动态检测 45疫组在一免后 15强免疫后抗体水平急剧升高。在二免后 21d 疫组的抗体水平达到峰值。而 45疫组抗体继续升高 ,在攻击感 染前达到最高。 5攻击感染时抗体水平仅为 4击感染后两组的抗体水平均呈现不同幅度的降低。未免疫对照组的抗体水平在攻击感染后 15后即缓慢下降。 注 ： 1 为第一次免疫时的血清抗体水平； 2为第二次免疫时的血清抗体； 4 为攻击感染时的抗体水平； 物保护实验 剖检结果表明 ， 疫组的减虫率较第六章的结果明显降低，减虫率从 95%就其原因可能是 存 3 个月后蛋白降解，免疫保护性降低所致。 45疫组的减虫率和完全保护率分别从 94%和 20%升高到 97%和 60%。说明保存 3个月后 45表 2. 重组抗原保存 3 个月后免疫猪囊尾蚴的剖检结果 组别 水泡样虫体 虫体总数 虫体平均数 减虫率 (%) 保护率 (%) 疫组 46,47,30,29,52,59 263 45疫组 0,0,5,0,7 12 0 未免疫感染组 135,77,57,46 315 0 图1 . 3 4 5 6采血时间（次） O 1 8 免疫组45 第六章 重组蛋白的稳定性分析 76 的免疫活性基本没有发生变化，略有升高可能与此次 实验的攻虫时间是在二次免疫后 45时 4而对攻击感染可产生较好的抵抗力。而 5以它们两者的减虫率差异较大。与前面的结果比较可以发现， 放置 3个月后免疫活性大大降低，而 45本保持了纯化时的免疫活性。 组蛋白稳定性的定量分析 通过 纯化的 45组蛋白 4 放置 1 个月后， 示蛋白条带无明显变化，含量测定结果与保存前基本相同 ，都保持在 月后含量略微下降，但保持在 明 45较稳定 ,可以在 4 保存 3 个月以上。而纯化的 放置 1 个月后， 白条带已明显减弱，至 两个月后蛋白浓度仅为 2.0 mg/明 白很不稳定，必须在纯化后 15 中国农业科学院博士学位论文 第六章 重组蛋白的稳定性分析 77 3 讨论 一般来说，真核基因在原核系统中表达量的影响因素很多，诸如不同的载体系统、菌种、诱导表达条件，以及目的基因本 身的碱基组成等。而且真核基因的在大肠杆菌中的表达产物容易受到宿主菌蛋白酶的水解，所以一般在蛋白表达和纯化时应加入一定量的蛋白酶抑制剂如 防止产物的降解。或者选择蛋白酶缺失的宿主菌表达外源蛋白，甚至对基因序列进行修饰，截去影响其稳定性的部分。 我们通过 于未用蛋白酶抑制剂处理，所以 4 保存3个月后，与第一次免疫实验相比，减虫率降低了 51%。推测可能是重组蛋白发生了部分降解。 蛋白含量测定进一步表明，该蛋白在 4 保存仅 1 个月， 蛋白就发生 降解，两个月后的浓度已经降低至不到原来的 1/3，说明该蛋白的免疫保护性的降低是由于蛋白不稳定造成的。而 45存 3 个月后的免疫保护性基本不变，减虫率和完全保护率均有所提高，两次实验结果显示较好的重复性。含量检测显示，放置 2 个月后 45从另一方面也验证了重组蛋白保存一定时期后，其保护性的高低还与该蛋白的稳定性密切相关。尽管 疫组的抗体水平在二次免疫后出现了与 45在二免后三周迅速降低，到感染前仅为 45体水平的一半。此时的抗体 水平可能不足以抵抗猪带绦虫的攻击感染，导致感染率的升高。同时本次实验免疫猪出现了较多的干酪样虫体，而且以肝脏和肌肉中多见。这在前面的免疫实验中所没有或很少见的，其原因是否与感染的时间以及剖检时虫体的发育程度有关尚需近一步研究。 羊全长 45W 重组基因工程疫苗问世，极大地鼓舞了人们用其它 45W 基因研制猪囊尾蚴疫苗的热情。但羊 45大肠杆菌中表达的产物很不稳定，大多以降解形式存在，因而大大影响了疫苗的实际应用，不能满足疫苗商业化发展的需要。而很多证据已证明， 稳定性影响很大。蛋白质结构预测分析发现羊 45W 和猪带绦虫 端都有 17 个氨基酸的分泌信号序列。 996)等研究认为当羊绦虫 45W 基因缺失 7个氨基酸时，表达蛋白的稳定性大大增加， 组抗原在 2以稳定保存 18 个月。本实验将猪 45 端 17 个氨基酸的信号肽序列截去后， 4合蛋白的稳定性大大提高，保存 3个月的免疫保护性仍然达 含量检测显示， 4 4 可稳定保存 3 个月以上。所以推测 白 N 端的 17 个氨基酸的信号 肽序列对 合蛋白的稳定性也会有影响。下一步应对 因进行修饰，截去其 N 端的信号肽序列，以提高该重组蛋白的稳定性，获得表达量高、稳定性好和免疫原性良好的重组蛋白。另一方面，纯化蛋白时加入蛋白酶抑制剂 抑制蛋白酶活性或选择蛋白酶缺失菌株作为宿主菌 可能也是解决 解的有效途径。当然用真核表达系统如酵母进行该基因的表达，不仅可以克服蛋白降解的问题，而且还能对 外源蛋白进行翻译后的加工和修饰，获得免疫保护性更好的重组蛋白。 中国农业科学院博士学位论文 第七章 结论 78 第七章 结论 1. 在国内首次成功克隆了 因，同源性比较表明 在不同地方株间比较保守。 2. 对 二者 7 个氨基酸的分泌信号肽， 9其它已知的宿主保护性六钩蚴抗原具有相似的结构特征。 45高度疏水的跨膜螺旋区 和大量 磷酸化、糖基化位点； 白有 1个糖基化和 4 个磷酸化位点，二者均定位于细胞外。由此推测 45能为六钩蚴阶段分泌的糖蛋白，并且可能具有酶的活性。 3. 在大肠杆 菌中成功表达了具有免疫活性的 5 45主要以可溶性形式高效表达 ,这种差异主要由重组蛋白的氨基酸组成所决定。 45明人囊虫血清中含有高滴度六钩蚴 抗体。 4. 初步揭示了重组抗原 5明感染前的抗体水平与重组抗原的减虫率密切相关，而囊尾蚴抗体水平与囊尾蚴虫体负荷间无相关性。重组抗原的免疫保护作用是细胞免疫和体液免疫共同作用的结果。 5. 国内外首次体外实 验证明，在补体参与下， 45体对六钩蚴的杀伤作用均有所增强，但在补体介导下 P=。说明 伤六钩蚴依赖补体的参与，由此推测 苗的免疫效果可能优于45 6. 在猪体确证了 45组疫苗良好的免疫保护效果，其减虫率分别达 95%和94%，与囊尾蚴粗制抗原的免疫效果（减虫率为 92%） 相当，而 80%，免疫效果优于囊尾蚴粗 制抗原免疫组，这一结果为进一步开发商品化 5 7. 通过猪体实验和含量检测，确定了重组抗原 45 4 的 保存期，证明了N 端信号肽序列对重组蛋白的稳定性影响很大，截去 N 端信号肽序列，或在真核系统中进行表达将会大大提高 中国农业科学院博士学位论文 第八章 文献综述：绦虫蚴感染后宿主免疫应答的研究 79 第八章 文献综述 绦虫蚴感染后宿主免疫应答的研究 绦虫蚴病是指由带科绦虫的中绦期寄生于中间宿主体内所引起的寄生虫病，对家畜和人危害最大最常见的主要有猪囊尾蚴病和棘球蚴病。绦虫蚴作为一种复杂的病原体 ，不仅抗原成分复杂，而且 不同发育阶段的抗原组份不尽相同，所以不同的发育阶段，即使同一阶段的不同感染时期所引起的免疫反应的程度和类型也不完全相同。一般而言， 寄生虫引起的免疫反应与细菌、病毒引起的免疫反应，无论程度和持续时间，前者都不及后者。寄生虫免疫通常表现为不完全免疫，血清中产生的免疫球蛋白与免疫保护不成比例关系。寄生虫若在某一宿主体内发育至成虫，以后则能在宿主体内长期生存下去。尽管宿主能识别虫体并产生免疫反应，但并不能将其完全杀灭或驱除出去。绦虫从感染性虫卵或幼虫进入宿主体内，到最终发育至中绦期（囊尾蚴或 棘球蚴），只是形态、大小和结构上的变化，而不象细菌和病毒可在动物体内大量繁殖或复制。因此研究虫卵或六钩蚴进入中间宿主体内后，宿主免疫系统将发生怎样的反应来应对外源物质的入侵，而虫体从六钩蚴到囊尾蚴的不同发育阶段又以什么方式降低自身的抗原性而不与宿主发生免疫反应，或以什么方式逃避宿主的免疫监视而得以生存，这些问题的阐明将有助于了解绦虫蚴的侵袭机制和宿主产生免疫应答的机理，为绦虫蚴病的免疫预防和诊断提供理论基础。 1 细胞免疫及细胞因子 从目前研究来看 ,寄生虫免疫主要由免 疫效应细胞和细胞因子承担。参与免疫的效应细胞有 噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、红细胞和杯状细胞等。 2002） 等研究了沙鼠和仓鼠猪带绦虫小肠粘膜的炎性反应，发现非免疫抑制小鼠嗜酸性细胞和嗜中性细胞适度增加，而杯状细胞和肥大细胞则大量增加。感染 613对照组的 4倍。而沙鼠肥大细胞在感染后 9d 有 8 倍的增加，这说明沙鼠和仓鼠猪带绦虫的驱除可能与杯状细胞和肥大细胞的增加有关，而且在不同动物模型中细胞的增殖有所不同。猪带绦虫感染猪后 ,宿主炎性细胞在囊尾蚴周围出现似乎 有先后顺序。 19是最先到达炎性部位的效应细胞。嗜中性粒细胞可释放嗜酸性粒细胞趋化因子 ( ,从而吸引大量的嗜酸性粒细胞在猪囊尾蚴周围聚集。虫体周围宿主反应主要是炎性细胞浸润 ,以嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞为主 ,并有较多的淋巴细胞 。 感染后 30d,巨噬细胞及上皮样细胞开始出现 ,但炎性细胞仍以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润为主 ,并 在炎性细胞外层开始出现结缔组织增生。随着感染时间的延长 ,虫体周围出现坏死 ,坏死细胞主要是嗜酸性粒细胞和淋巴细胞 ,同时巨噬细胞和上皮样细胞变得非 常活跃 ,在虫体周围呈围墙样增生 ,试图吞噬或消灭虫体 ,当无法消灭时 ,在虫体外围形成结缔组织包囊使其局限在某一部位（ 刘永杰等， 2003） 。通过颅内感染 c 小鼠猪带绦虫相关种建立动物模型研究 病免疫应答和相关的病理变化是研究 有效手段。免疫应答显示 薄壁细胞外区域 大量的炎性渗透出现在感染后 2d，相反免疫细胞向 薄壁组织的渗透大大延迟。感染鼠早期诱导 细胞为主的适应性免疫应答， 中国农业科学院博士学位论文 第八章 文献综述：绦虫蚴感染后宿主免疫应答的研究 80 et 2004） 。 胞免疫与疾病病程的关系 尽管在囊尾蚴感染的早期炎症细胞发挥着重要作用，但 中 挥细胞毒性作用 ,直接杀伤虫体寄生细胞，而 细胞主要通过分泌淋巴因子参与免疫反应。针对不同的寄生虫感染 ,化为 以 主要作用寄生于细胞内的虫体。 此 研究不同细胞因子对免疫应答的调节，有助于了解抗寄生虫的免疫应答 。 要了解抗寄 生虫的免疫应答怎样朝杀灭寄生虫方向发展或者怎样朝寄生虫慢性感染方向发展 , 则需要研究淋巴细胞分泌的细胞因子以及间的平衡关系。 (2002)研究认为，在猪囊尾蚴病和棘球蚴病中， 具有活囊尾蚴和棘球蚴的宿主个体，细胞免疫倾向于 寄生虫被杀灭或生长受到限制的个体细胞免疫倾向于 2002） 将自然感染猪囊尾蚴的猪淋巴细胞的炎性反应分为 1， 3， 5三级， 1级炎症反应仅有少量嗜酸 性细胞和单核细胞的炎性渗透， 胞远多于 3级反应中肉芽肿尚未形成，而虫体开始降解，此时尽管 胞明显增加，但 5级中虫体周围有广泛的肉芽肿性渗透，淋巴细胞亚群数量减少，除 级无区别。因此积极抵抗猪囊尾蚴的炎性反应应包括 免疫反应的强度和类型还与寄生虫的活力和解剖部位有关。在用猪带绦虫提取物和巨颈绦虫囊液作为刺激物，分析淋巴细胞培养上清中的细胞因子产生，发现炎症病 人具有较高水平的 ,而非炎症病人和对照组 炎症病人的脑积液（ 6%和 40%。所有检测的细胞种群中 明显优势。当用 炎症病人主要产生 症病人淋巴细胞对体外刺激表现 非炎症病人却 表现 et 004)。 2000） 评价了 动期炎症性病人 明在 大多数炎症损伤中细胞介导的免疫应答是非常明显的， 包括 内的促炎性细胞因子占优势，而未检测到 此，认为中枢神经系统（ 该寄生虫的应答与全身 性应答不同，是 免疫应答。 在 泡状包虫病的研究中，发现失败性（ 病人产生的细胞因子与进行性(人相反，而阳性血清病人则出现介于两者间的中间类型。失败性 人的 一结果确证了 et 000)。 染强度与细胞免疫的类型 中国农业科学院博士学位论文 第八章 文献综述：绦虫蚴感染后宿主免疫应答的研究 81 研究发现，宿主接触寄生虫的数量与宿主产生免疫应答的类型密切相关， 即细胞免疫的类型和强度与感染的剂量有关。 2003)在分析小鼠感染细粒棘球蚴后早期和晚期细胞因子的应答时发现，接种 500个原头蚴的小鼠脾细胞早期诱导 接种 2000个原头蚴的小鼠早期诱导 且低剂量感染组的寄生虫的生长水平较低，说明在棘球蚴感染中细胞因子的应答取决于宿主接触寄生虫的剂量。 芽肿阶段的细胞免疫 肉芽肿的形成是宿主免疫系统与囊尾蚴之间斗争的结果，有利于宿主的免疫反应。一些研究已证实，由肉芽 肿引起的炎症反应与包囊中虫体的濒临死亡有关。尽管入侵的幼虫能被免疫血清和补体杀死，但包囊阶段的免疫却依赖于细胞免疫。 在囊尾蚴病早期肉芽肿与 后期肉芽肿反应中寄生虫虫体被完全破坏，为 此 答显然在猪囊虫致病机理和清除寄生虫方面起重要作用。 1998） 进行了 8份猪囊尾蚴周围的肉芽肿样品的组织学和免疫组化分析，结果表明所有成熟的肉芽肿样品都由相关联的纤维化、血管发生和炎性浸润组成，里面包裹着濒临死亡的囊尾蚴。在肉芽肿周围最丰富的细胞是浆 细胞、 噬细胞、肥大细胞，以及包括 在内的 此肉芽肿的形成对于杀灭寄生虫具有重要作用。细胞免疫虽然限制了细胞外病原的扩散，但免疫应答的效率决定于病原特异性记忆 2002)的研究结果表明， 细胞明显增加，而且光谱分型显示只有 细胞受体增加。这为 细胞具有活性作用提供强有力的证据。 2004)研究了不同免疫缺陷小鼠 细胞种群在控制实验性多房棘球蚴感染中的作用时也发现 细胞在限制其生长中起主要作用，而 细胞和 生虫周围没有肉芽肿形成，脾细胞对 和抗原刺激的应答降低。在 ）都增加，与寄生虫的高负荷相一致。因此抗多房棘球蚴感染不依赖于 而依赖于细胞介导的效应因子的功能。 2 体液免疫 主对初次感 染的抗体应答 寄生虫感染过程中的一个显著特点是宿主外周血中嗜酸性细胞明显增多，而且主要是