【毕业学位论文】（Word原稿）甘蓝型油菜株高和开花时间的QTL定位及黄籽性状的分子标记作物遗传育种博士论文

密级 : 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 甘蓝型油菜株高和开花时间 的 位及黄籽性状的分子标记 of of of of 要 油菜是全世界广泛种植的重要油料作物。油菜株高、开花时间及种皮颜色分别在油菜的抗倒伏、产量形成及品质育种方面具有重要作用。已往对这三个性状的研究结果还不能满足目前的育种需求，本研究利 用一个新发现的甘蓝型油菜矮秆早开花特异材料，研究株高和开花期的遗传规律，并进行 用甘蓝型黄籽油菜和黑籽油菜的 选与黄籽基因紧密连锁的分子标记；创建甘蓝型黄籽油菜的 体，为进一步深入开展黄籽性状的遗传和分子研究奠定基础。主要研究结果如下： 1. 对 矮秆 早开花 突变材料 99091杂交后代的遗传分析结果表明： 99对隐性基因控制，存在母体细胞质效应；早开花性状主要由单隐性基因控制；株高和开花时间之间存在显著正相关（ r= 2. 利用含 145 个 家系的分离群体，构建了一张 包含 199 个 记和 34 个 记的甘蓝型油菜遗传图谱，这些标记被分配到 20个连锁群和 4个二联体中，遗传图距总长为 3. 利用 家系对株高进行 标记分析法在第 13连锁群 (检测到 1个 区间作图法（ 复合区间作图法（ 检测到了 5个 献率分别在 间。 4. 利用 家系对开花时间进行 标记分析法检测到 2个 测到 4个 别解释 表型变异。用 种方法均检测到 1个共同的 个贡献率为 还在 检测到 1 个贡献率为 3 种方法在两年内共检测到 5 个与开花时间有关的 中 种方法在两年内都检测到的 5. 存在控制开花时间的主效 个 也同时存在控 制株高和开花时间的 连锁不紧密。 6. 以甘蓝型黄籽油菜和黑籽油菜的杂交种渝黄 1 号为试验材料，用 株黑籽单株和12株黄籽单株的 别构成黑籽 集团和 黄籽 集团 。通过 选了 96 个 73对 定出与显性黄籽基因连锁的 1个 35个 039230，它们位于与显性黄籽基因的两侧，与黄籽基因的遗传距离分别为 外还发现1个 055240，与深色种皮有关。 7. 用渝黄 1号的 出胚率明 显低于黑籽油菜。采用小孢子苗直接移栽大田技术，成活率达到 经染色体加倍后，最终获得含有 127个 的黄籽油菜 体。 关键词： 甘蓝型油菜，株高，开花时间，黄籽， 位 is an in in on t In a to of to of 2 a of a a to to a of as 1. A 091 a 91, by of by of r =). 2. A a 45 9 2091. It 99 4 0 in 094.6 cM of 2:3 to of TL on 13 by by of (of 4. 2:3 to of by IM IM in % of 2 to of a by IM TL of TL G6 IM In to in by TL of TL of 6. 2 2 of a B. o.1 a a to 73 IV SR 35SR 039230 to be to a at SR 055240, to be to 7. o. 1 F1 of to up a DH 27 DH V 目 录 第一章 文献综述 1 蓝型油菜株高、开花时间和黄籽性状的研究 1 蓝型油菜株高的研究 1 蓝型油菜开花时间的研究 2 蓝型油菜黄籽性状的研究 3 用分子标记 5 子标记的特点及种类 5 制性片段长度多态性 5 机扩增多态性 5 单序列重复 6 增片段长度多态性 6 量性状基因定位 7 位的原理 7 位的常用方法 8 物 特性 9 子标记在油菜遗传育种中的应用 9 菜分子标记遗传图谱的构建 9 菜重要性状的 分子标记和 基因定位 12 菜分子标记辅助选择研究进展 16 菜小孢子培养研究 17 孢子培养技术的研究 18 孢子培养在油菜遗传 育种中的应用 21 在问题 25 研究的目的意义 25 第二章 甘蓝型油菜株高和开花时间的遗传分析 27 言 27 材料与方法 27 料 27 间 试 验设计 28 状调查 29 果与分析 29 株高 29 开花时间 33 株高和开花时间的相关分析 34 论 35 秆性状的遗传机制 35 制株高性状的基因对数 35 高和开花时间的关系 36 三章 甘蓝型油菜株高和开花时间的 析 37 言 37 料与方法 38 本材料 38 间试验及性状考察 38 取及纯化 38 析 39 析 41 电泳及染色 41 因型记载 41 据分析 42 果与分析 42 图亲本纯度分析 42 图亲本之间 物组合的筛选 42 物筛选 44 子标记连锁图构建 45 高和开花时间的 位 45 论 52 响 位准确性的主要因素 52 数目及其效应 53 状相关性 54 第四章 甘蓝型油菜显性黄籽基因的 55 言 55 料和方法 55 料 55 验方法 56 果与分析 56 物组合的筛选 56 黄籽基因连锁的 记 57 57 黄籽基因连锁的 记 58 同种皮色泽的种子含油量比较 59 论 60 离群体分组分析法 60 籽性状的分级 60 第五章 甘蓝型黄籽油菜 体的构建 62 言 62 料与方法 63 料 63 究方法 63 果与分析 64 同基因型组合材料对出胚率的影响 64 水仙素处理小孢子对出胚率的影响 64 一组合不同单株对胚产量的影响 64 生植株的移栽及加倍 64 论 66 彩图版 67 参考文献 69 附录 85 致谢 87 作者简历 88 略语表 H M G B of 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 第一章 文献综述 油菜是世界第三大油料作物，也是我国的主要油料作物。油菜籽含油量高（一般为 3844%），榨油成本低，菜籽饼可代 替豆粕作蛋白质饲料，近年来菜籽油约占我国食用植物油消费量的35%，菜籽饼约占我国植物饼粕消费量的 25%（王汉中， 2004）。当前国际市场油菜籽供大于求，加拿大、法国等油菜主要出口国都实现了从种到收的全程机械化，生产成本低，菜籽含油率普遍在 40%以上，比我国长江流域及黄淮冬油菜区含油量高 2百分点，低成本价和高含油量抵消了长途运输的成本，冲击着我国油菜生产的发展，特别是冬油菜集中的产区，同时大部分中、小型油脂加工企业也将受到很大的冲击，面临转产和资产重组的局面（李加纳， 2002）。油菜生产产量高低、品质优 劣将是关系到国民经济发展和社会稳定的重大问题。研究油菜主要经济性状的遗传规律，不断挖掘和利用新的种质资源，是油菜新品种选育的基础，也是我国经济发展的必然要求。 蓝型油菜株高、开花时间和黄籽性状的研究 蓝型油菜株高的研究 甘蓝型油菜产量高，是油菜中最重要的栽培种。杂种优势是生物界普遍存在的一种现象，利用杂种优势是提高作物产量最为有效的一种途径，随着甘蓝型油菜育种方向朝着杂交品种发展，油菜株高平均增加了 20右 (et 1995)，倒伏问题越来越严重。倒伏一方面会 导致产量的严重损失，另一方面也使机械化收获无法进行，因此培育矮秆品种既可以在一定程度上保证稳产，又有利于实现机械化收获。 （ 1995）用化学诱变剂 传分析表明该突变体的矮秆性状受一对隐性基因（ 制。他们通过回交将该矮秆突变基因导入大量不同的甘蓝型油菜品系中，得到了矮秆或半矮秆的后代。这些后代的抗倒性和产量性状的表现均比轮回亲本有所改善。浦惠明等（ 1995）研究了一个从澳大利亚引进的甘蓝型矮秆油菜“矮源 1 号”的遗传，发现矮秆性状受一 对显性基因控制，显性度为 通油菜具有一对隐性高秆基因。黄天带（ 2003）对矮秆突变体 的矮秆基因进行了遗传分析，发现 向矮秆，表现部分显性，显性度为 反交 ： 3的分离规律， ： 1， s 1 回交后代全部表现矮秆，由此推断， 1 的矮秆性状受一对不完全显性基因控制，不存在细胞质影响。以上结果说明甘蓝型油菜株高的遗传比较复杂，不同矮秆材料中矮秆基 因的对数及等位基因的显隐性关系可能不同。在矮秆基因的利用过程中，应该根据不同材料的遗传机制加以灵活运用。甘蓝型油菜株高受外界环境的影响较大，依据单株的表现型进行株高选择的准确率较低，借助分子标记对该性状进行辅助选择，则可以排除外界环境条件及细胞质效应对表型的影响，提高选择效率。 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 在株高性状的分子标记研究方面， （ 1995， 1996） 对矮秆基因 记作图，有 8个 记与 近的标记 据 序列设计了对矮秆基因附近位点进行扩增的特异引物，这样就可以对这一类型的突变矮秆等位基因在任何遗传背景的材料中进行检测，他们在 40份甘蓝型油菜中发现了三个矮秆等位基因。黄天带（ 2003）对矮秆材料 的不完全显性基因 用 进行 记，筛选了 1041 条引物，找到 1 个与 传距离为 （ 1999） 对甘蓝型油菜的单株产量、含油量和植株高度等性状同时进行 位，鉴定出 4 个与株高有关的 解释 体 株高表型变异。沈金雄（ 2003）对产量性状和株高进行了 析，对于株高性状，在武汉点检测出 4个有显著效应的 别位于第 7、 11 连锁群；荆门点检测出 2个 别位于第 1、 11连锁群。即两点一共检测出 个 中两点相同的 于第 11连锁群的 间。它们解释的方差变异为 这 5 个 部表现为不完全显性。 株高属于质量 （ 1995， 1996） 和黄天带（ 2003）的研究都只对控制矮秆性状的单个主效基因进行了分子标记，未能将效应较小的基因进行定位； （ 1999） 和沈金雄（ 2003）虽然对株高性状进行了 位，但他们所用的亲本的株高差异都在 40能还有控制株高的主效基因由于亲本间性状差异较小而未能定位出来，因此有必要采用性状差异很大的高矮亲本对控制株高性状的 行鉴定。 蓝型油菜开花时间的研究 油菜开花时间的选择对于 保证花朵在最适条件下授粉以及种子形成非常重要（ et 2000）。油菜开花时间也是决定其成熟期早晚的一个重要指标。早熟在许多地区是高产稳产的重要条件，早熟品种可以避免生育后期的高温逼熟或干热风等灾害的为害，或减轻受害程度，在我国南方地区实行油 稻 稻一年三熟，油菜早熟能为后作物及早腾地，保证后作物的高产稳产。但早熟和丰产之间也存在一定的矛盾，因此不同生态地区应根据当地对品种熟期的要求，因地制宜地选育熟期适当的品种。而只有掌握了油菜开花期、成熟期的遗传规律，我们才能在育种的过程中进行杂 交组合的灵活选配，得到我们预定花期或熟期的品种。 油菜开花时间受其种性（即春冬性）和光周期的影响。根据油菜春化阶段对温度的要求，将油菜分为冬油菜和春油菜两种类型。冬油菜因苗期对低温的要求不同又分为冬性、半冬性和春性。冬性油菜苗期需 0的低温，经 20才能通过春化阶段进行花芽分化 ；半冬性油菜苗期对低温的要求不太严格，介于冬春性之间，一般需 5的温度经过 20春性油菜苗期需 10的温度，经过 15即可进行花芽分化 ；春型油菜苗期对温度的要求与春性油菜类似。油菜通 过春化阶段后进入光照阶段，油菜属长日照作物，春油菜对光长敏感，需经过 14 小时以上的日长才能现蕾，缩短到 12 小时则不能正常现蕾开花。但冬油菜品种对光照长度属弱敏感型，对长光照不敏感，现蕾开花前经历日长 11小时左右即可 ，但 也有高于 14 小时或 者 低于 10 小时的品种 。以往的研究认为甘蓝型油菜的种性受两对基因控 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 制（西北农学院， 1981），而对控制同一类型油菜开花时间早晚的基因报道很少。 开花时间和春化要求的 （ 1995） 用 交 04个 ， 对幼苗采用 22不春化， 4化 4 星期和 4化 8星期三个不同处理，结果在未春化群体中，在第 9 连锁群上有 7 个连锁标记与春化要求（一年生 /两年生习性）紧密相关，其中 相关程度最高。在三个不同处理的群体中，开花时间都与第 9 连锁群中间紧密相关，此外，在未春化和经 4 星期春化处理的群体中， 16连锁群）区域以及在未春化处理中， 12连锁群上的 域也与开花时间紧密相关。 （ 1997） 发现在第 9 连锁群上有两个与开花时间 有关的基因，其中一个与春化要求有关。比较作图发现甘蓝型油菜的开花时间基因可能与拟南芥上控制开花时间的基因 5染色体顶端）及 4 染色体顶端）有关。 （ 1999） 用 4 个 体鉴定出9 个与开花时间有关位点， 点以及 点对开花时间影响最大，最终的多位点模型可解释 遗传变异。 （ 1995a） 发现包含与春化要求有关 两个白菜型油菜连锁群 甘蓝型油菜的 别有 4 个和 2个相同的 点，说明甘蓝型油菜 能与春化要求有关。以上对开花时间的研究都是利用春油菜和冬油菜产生的杂种后代进行的，而我国种植的主要是 冬油菜 （包括冬性、半冬性和春性 冬油菜 ），若利用两个开花时间差异大的冬油菜产生的杂种后代进行开花时间的鉴定出的有关数量性状位点，在我国油菜育种中会更有利用价值。 蓝型油菜黄籽性状的研究 在相同遗传背景下，黄籽油菜与黑籽油菜相比，具有种皮薄，种子含油量高，饼粕蛋白质含量高，纤维素和多酚含量低，油质清亮，种皮对加工品质影响小等优点，因此 黄籽油菜的研究和利用已越来越受到国内外育种工作者的关注。 自然界中存在许多白菜型和芥菜型的黄籽油菜，但没有天然的甘蓝型黄籽油菜。960)从人工合成的甘蓝型油菜中首次发现了黄籽单株，但其遗传行为十分复杂，很难育成稳定的黄籽品种。 1975 年，刘后利教授从甘、白种间杂种华油 3 号株系繁殖的后代中发现了 1 株甘蓝型黄籽油菜（刘后利， 1979），拉开了我国甘蓝型油菜黄籽育种工作的序幕。随后吴江生等（ 1997）从华黄 3号的衍生系中发现显性黄籽突变种质 933044，黄先群等（ 2001）从贵州省农科院选育的“黔 育低芥 1 号”中发现黄籽材料，从引进的材料“秦油 3 号”中也发现了黄籽材料。这些黄籽油菜的发现为研究甘蓝型油菜黄籽性状提供了宝贵的资源。 甘蓝型黄籽油菜的种皮颜色为土黄或姜黄，在黄色种皮背景上，有不同程度的黑色斑点、斑块以及褐色的环状带纹；黄籽性状遗传不稳定，即使自交 10 代以上，黄籽单株中仍有种皮颜色的分离，甚至在同一个角果中也有黄、黑籽分离（王汉中， 1990；刘后利， 1992）。连续自交可以提高黄籽的频率，但连续自交易出现一系列退化现象，如矮化株、分枝减少，角果缩短、角果粒数减少等，其中最严重的是出现子叶黄化 现象。甘蓝型油菜黄籽性状的遗传复杂，不同研究者采用不同黄籽材料进行研究的结果不同。多数研究认为，黄籽性状的表现至少受 2隐性基因控制，当几个位点都为隐性时产生黄籽单株（李云昌， 1984；刘后利， 1992； 国农业科学院博士学位论文 文献综述 等， 1992）。 （ 1994）利用 H 群体对甘蓝型油菜种皮色泽进行研究的结果也表明：黑籽对黄籽为显性，种皮颜色受 3 对基因控制， （ 2003）利用 体研究黄籽的遗传，发现种皮颜色符合加性或 3 个显性基因互补的遗传模式，当 3 个基因为隐性时种籽为 黄籽。与以上研究结果基本一致，可能研究材料在遗传模式上属于同一类型的黄籽油菜。（ 1999）发现甘蓝型黄籽性状受 2对独立遗传的显性互补基因控制；吴江生等（ 1998）发现黄籽突变体 933044 受 1 对显性黄籽基因和 1 对上位显性黑籽基因互作控制；陈宝元（ 1985）认为甘蓝型油菜粒色可能受 2 对基因（ 制，当 点为显性时，种皮为黑色；点为显性时，种皮为黄褐色，当两位点都为纯合隐性时，种皮为黄色。李加纳等（ 1998）用 7 个不同来源的黄籽油菜品系进行完全双列杂交，后代的 分析结果表明：这 7 个材料，有的带有相同的黄籽基因，它们的 的部分位点带有等位性，的双亲不具等位基因，它们的 传背景不同的黄籽品系带有不同的黄籽基因，这些黄籽基因有的表现为完全显性，有的为部分显性，有的为隐性，且其在后代的表现力各不相同。如渝黄 1 号的黄籽亲本 含有完全显性的黄籽基因。西南农业大学采用 母本与褐籽品种中油 821杂交， 1代黄籽株率 100%，黄籽度（籽粒表面黄籽所占比率）略低于母本。 6制的渝黄1 号（谌利等， 2002a,2002b）的黄籽外显率达 100%，黄籽度达 90%。而有关渝黄 1号中黄籽性状的遗传规律目前仍不清楚。黄籽性状还受母本基因型的影响以及母本与胚乳和 /或胚基因型间互作的影响（ 994），此外环境条件的改变、农艺措施的不同都可以使粒色发生改变（ 993；李敏等， 1999）。正是因为黄籽性状的复杂性，使得用常规育种方法选育甘蓝型黄籽油菜的难度很大，我国至今在生产上应用的只有华黄 1 号，宁油 10 号和渝黄 1号 3 个甘蓝型油菜黄 籽品种。而寻找与黄籽基因紧密连锁的分子标记，采用分子标记进行辅助选择将在很大程度上有助于甘蓝型黄籽油菜的选育。 在甘蓝型油菜黄籽基因的分子标记方面， （ 1995） 用 体进行了黄籽的质量性状标记和 位，两种方法都表明位于 C 连锁群上的 记 4控制籽粒颜色的基因连锁，该标记可解释 24%的表型的变异； 一标记 于 解释 7%的表型变异。 2001） 在 因 该基因两侧有 8 个 记与黄籽共分离，这个基因可解释 72%的种皮颜色表型变化；总共发现 11 个标记，覆盖了控制黄籽性状的所有 3 个位点，上述两项研究都是针对隐性基因控制的黄籽性状。刘雪平（ 2004）采用黄籽材料 黑籽材料反交 该组合 第 18 连锁群上的 1个主效 不同年份可解释 遗传变异。迄今为 止，有关完全显性黄籽基因的分子标记研究未见报道。 提高产量和改良品质是作物育种的两个主要目标，优质黄籽与杂种优势利用相结合，将是油菜育种的一个新的发展方向。在黄籽油菜杂种优势利用的过程中，显性黄籽基因与以往研究的隐性黄籽基因相比，具有配组灵活的优点，只要亲本之一具有该性状，就有可能生产出黄籽显性黄籽基因在不同的遗传背景中表现力各不相同，借助显性黄籽基因的分子标记，将使我们能够对显性黄籽基因在后代中进行有效跟踪，这对于黄籽性状的转育具有重要意义。 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 用分子标记 子标记的特点及种类 子标记是在分子生物学基础上发展起来的新一代遗传标记，与原有的遗传标记（形态标记、细胞标记、生化标记）相比，具有以下优点： 1）不受发育阶段的影响，可以对个体、组织、器官乃至细胞作检测； 2）不受环境因素以及基因是否表达的影响； 2）数量非常丰富，几乎无限； 3）有些标记是共显性标记，对选择隐性基因控制的性状十分有利； 4）遗传稳定，表达中性，无表型效应。这些优点使分子标记在物种起源与进化、生物多样性、遗传图谱构建、基因定位 以及 分子标记辅助选择等方面得到了广泛应用。 目前，国内外已经开发出十几种 子标记技术，根据技术原理的不同，分子标记可分为四大类： 1）基于 交的 记，如 2）基于 增的 记，如 ； 3）基于 记，如 ； 4）基于单核苷酸多态性的 记，如 下仅叙述在作物遗传育种中常用的 子标记技术。 制性片段长度多态性 （ 最早的分子标记技术，由 1974 年创立。它是利用放射性同位素或某些非放射性物质标记随机的基因组克隆和 隆的单拷贝或少数拷贝序列或中度重复序列的探针，与转移于支持膜上的、经限制性内切酶消化的基因组总 交，通过显示限制性酶切片段的大小来检测不同遗传位点等位性变异（多态性）的一种技术。其原理是基于生物的核苷酸差别，个体间的核苷酸差别表现在对某种限制性核酸内切酶的结合点和切点不同，酶切的结果表现在个体间的 段长短不同， 电泳时即出现不同的谱带。 检测到单碱基突变、缺失、易位、倒位、插入等多态性类型，多态性水平中等，共显性遗传，可靠性高（ et 1980）。在油菜中， 记的应用很普遍，主要用于遗传连锁图谱的构建、基因定位、与拟南芥进行比较作图等方面（ et 1989,1990； et 1991; et 1994; et 1994; et 1994; et 1996; et 1996,1998 ） 。然而， 记也有不足之处，其操作复杂、耗时耗资，而且有效探针来源也有限（只有 隆、基因组克隆和 种），这都在一定程度上影响了该标记的广泛应用。 机扩增多态性 1990）等提出，是建立在 础上的第一个分子标记技术。 于双引物在整个基因组 结合位点间存 在长度上的差异，经 增后，可用电泳检测到这种差异，表现为一种多态性。 与其它标记相比， 有以下优点： 1）不依赖于种属的特异性和基因组的结构，合成的一 套引物可用于不同生物基因组的分析。 2）操作简 中国农业