【毕业学位论文】（Word原稿）枯草芽孢杆菌B-332菌株及其抗菌物质对稻瘟病的生防作用研究微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 枯草芽孢杆菌 株及其抗菌物质对稻瘟病的生防作用研究 I 摘 要 水稻稻瘟病（ 一种世界性真菌病害， 对全球水稻生产造成极大危害。 寻求 对 病害的生物 防治 方法对人类社会的可持续发展有着特殊的意义。 本论文 以 枯草芽孢杆菌 (B. 株 （以下简称 及其产生的抗菌物质为研究对象， 通过从室内到田间的一系列实 （试） 验， 对 该菌株对稻瘟病 （菌） 的 生防作用 和抑菌机理进行 了 较为 系统 地 研究 。 结果如下： 1、 在离体条件下， 对稻瘟病菌的菌丝生长、孢子萌发和致畸作用等 方面 进行 了 研究 ，结果发现， 稻瘟病菌表现出了强烈的抑制作用。抑菌带宽平均可达 酵上清液稀释 5和 10时对菌丝生长的抑制率在 92%以上 ； 5、 10和 20稀释液对病菌分生孢子萌发的抑制率为100%。 在发现对芽管有致畸作用后， 对致畸率 进行了 测定 。发现 发酵上清液 稀释至 100 200时对芽管的致畸率最高，在 70%以上，至 2000时仍有致畸作用 。 2、 盆栽水稻活体生物测定中， 芽孢菌体悬浮液及发酵上清液均表现出较好的防治效果（ 50%以上）； 当菌液 与 上清混合后其防治效果 有加和作用； 该菌株对稻瘟病的防治作用主要在预 防， 其预防叶瘟的效果与接种稻瘟病菌时叶面已定殖的 株的数 量有关； 在人工大量引入的情况下，该菌能够在水稻叶 面 上有效定殖， 第 21 天还能够检测到 一定量 的活菌，并且在叶面有 10%病斑的情况下，菌量会更多 。 田间试验结果表明， 芽孢浓度在 1108 ， 该菌株对水稻 穗 颈瘟的防治效果达 增产率达 且 浓度在 5108 对螃蟹 乃 无毒性 。 3、 通过显微镜观察发现， 株 对稻瘟病菌的抑制作用主要表现在对芽管及菌丝体 的 致畸作用， 经上清液处理的 芽管和菌丝 成 球形膨大 状， 最 终导致细胞质外泄 、 细胞 崩溃。 这种致畸作用导致 的 畸形 芽管， 进而 不能形成正常的附着胞。 透射电镜观察进一步 发现 ，经上清处理后，稻瘟病菌的细 胞外壁 有被 溶解 的现象。 4、 对 株发酵上清液中的抑菌物质 进行了 粗提 。 粗提物在浓度为 即对稻瘟病菌有明显的抑制作用， 并且有很好的热稳定性 。粗提物 5浓缩液对稻瘟病的实际防治效果 好于对照药剂三环唑 。 关键词 枯草芽孢杆菌，稻瘟病菌， 生防作用 ， 定殖作用， 作用机理 by to is to a on to in of of on as (1) B. . in of DA A of 800 0 ; 0 , 00 200 , 0% of (2) In 0%) of of by is on of on . on be 1 on 0% In of 108 no to 108 (3) . at to of of . by At is to (4) M. by of in of 录 摘 要 . I . 一章 绪 论 . 1 瘟病对水稻的危害 . 1 瘟病的防治研究进展 . 1 草芽孢杆菌用于植病防治的研究概况 . 8 草芽孢杆菌用于稻瘟病防治的研究进展 . 9 草芽孢杆菌拮抗作用机理研究进展 . 10 研究的目的和意义 . 12 第二章 枯草芽孢杆菌 稻瘟病菌的抑制作用 .料和方法 . 14 验材料 . 14 验方法 . 15 果与分析 . 16 株对稻瘟病菌的平板拮抗作用 . 16 酵上清液对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用 . 16 酵上清液对稻瘟病菌分生孢子萌发的抑制作用 . 17 酵上清液对稻瘟病菌分生孢子芽管的致畸作用 . 18 结与讨论 . 19 第三章 枯草芽孢杆菌 稻瘟病的防治效果评价 .料和方法 . 21 验材料 . 21 验方法 . 21 果与分析 . 24 养物在室内盆栽水稻上对稻瘟病的实际防治效果 . 24 养物在室内盆栽水稻上对稻瘟病的混合防治效果 . 25 治稻瘟病的最佳时期 . 25 株在田间小区对稻瘟病的防治效果 . 26 株对螃蟹的毒性 . 26 结与讨论 . 26 第四章 枯草芽孢杆菌 水稻上的定殖作用 .料和方法 . 28 验材料 . 28 验方法 . 28 果与分析 . 29 种稻瘟病菌时稻叶初始定殖菌量与最终的防治效果 . 29 株在水稻叶面上的定殖情况 . 29 结与讨论 . 30 第五章 枯草芽孢杆菌 稻瘟病菌的作用机理研究 .料和方法 . 31 验材料 . 31 验方法 . 31 果与分析 . 32 分生孢子畸形芽管的显微跟踪观察结果 . 32 成熟菌丝体的致畸作用 . 33 酵上清处理的稻瘟病菌的透射电镜观察结果 . 33 结与讨论 . 34 第六章 枯草芽孢杆菌 株抗菌物质的初步研究 .料和方法 . 35 验材料 . 35 验方法 . 35 果与分析 . 36 株发酵上清中初提物质的抑菌活性 . 36 酵上清中初提物的抑菌活性与浓度关系回归分析 . 37 酵上清中拮抗初提物的热稳定性 . 37 酵上清中拮抗初提物浓缩液的活体防治效果 . 38 结与讨论 . 38 第七章 结论与讨论 .论 . 40 论 . 41 参考文献 . 谢 .者简历 .国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪 论 瘟病 对水稻的 危害 水稻提供世界食物能量的 20%，而小麦和玉米分别占 19%和 5%1。我国是世界上最大的稻谷生产国 ， 年均生产稻谷 吨，约占世界稻谷总产的 35，为世界第一 2。我们用占世界 9的耕地养活了占世界 22的人口，而水稻种植面积约占全国耕地面积的 26%，年产量 约占全国粮食总产量的 43%3。 水稻与其它农作物一样，也受到自然界各种病害的侵扰。在全世界范围内，稻瘟病 (纹枯病 (和白叶枯病（ 公认的水稻三大病害 48。另外还有水稻恶苗病 (水稻细菌性条斑病 (也很严重 9。 水稻稻瘟病 又称稻热病、叩头瘟等10， 是世界性真菌病害，曾被列为水稻三大病害之首 11。该病病菌属于半知菌亚门、丝孢目、梨形孢属，使水稻从秧苗至抽穗后期都可能发病，并可侵染植株的叶、苗、穗、颈、节、粒等多个部位。因此根据稻株受害时期和部位的不同可分为：苗瘟、叶瘟、节瘟、叶枕瘟、穗颈瘟和谷粒瘟。特别是造成的叶瘟、苗瘟、穗颈瘟常会危害成灾 12。 稻瘟病分布广泛，全球 80 余个国家均有发生，危害严重。仅稻瘟病在日本，就占全部稻谷产量损失的 50。在菲律宾等东南亚国家，稻瘟病被认为是分布最广和最具毁灭性的病害，每年都造成严重损失， 1975 2000 年间全世界 11% 30%的水稻因稻瘟病而颗粒无收，据统计， 19751990 年由稻瘟病引起的全球粮食损失高达 。并且它也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一，每年均有不同程度的发生，流行年份，重病地区一般减产 10% 20%，重的达 40%50%，局部田块甚至颗粒无收 3, 1216。 瘟病的防治研究进展 多年来，科学工作者在对稻瘟病菌进行深入了解的同时也在不断加强防治方法的研究 。 目前防治稻瘟病主要是在 “ 综合防治 ” 的指导思想下以选育抗病品种为主，同时加强肥水管理以增强水稻的抗病能力，并在发病期间及时辅以药剂防治，其中以抗病品种应用，合理利用抗病性如抗性品种轮作、品种多样性及抗药性并与化学农药和生防药剂相结合、多种药剂交替使用等为最重要的措施 35, 37, 38。 瘟病 菌的 特性 病菌以分生孢子或菌丝体在病谷和病稻草上越冬。种子上的病菌在温室或薄膜育秧的条 件下容易诱发苗瘟；露天堆放的稻草为第二年发病的主要侵染源。来年春，当旬平均气温达 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 15 ，遇到雨湿，稻草上的 病菌开始活动，不断产生分生孢子，借风雨传播使稻株感病，长出后继续产生分生孢子进行再侵染。病菌发育最适温度为 25 28 。高湿度有利于分生孢子的形成和萌发，而高湿度持续达一昼夜以上，则有利于病害的发生与流行。该病原菌具有如下特点： （ 1）生理小种多样性。病原菌 (半知菌梨孢属，其有性阶段为 (子囊菌 。该病菌 寄主范围很广，涉及到 15 科、 66 个属、 118 个种、 3 个亚种，并且存在致病分化变异性 17, 18。 1922 年日本学者佐佐木首 次报道了稻瘟病菌存在致病性不同的两个生理小种 A 和 B19。二十世纪 50 年代以后，病菌的生理小种得到了广泛的研究。以日本为首，各国开始纷纷建立由多个水稻鉴别品种组成的稻瘟病菌生理小种鉴别品系。至今，世界上产稻国家或地区建立和利用的鉴别品种达 10 多套 20。我国在 1976 1979 年经 全国稻瘟病菌生理小种联合试验组 的研究，提出了全国统一的鉴别方法和 7 个鉴别品种，并对在来自全国 23 个省 (市 )、自治区的稻瘟病标样上分离获得的 1197 个菌株进行了鉴定，共鉴定出 7 群 43 个小种。又据罗耀光汇总全国稻瘟病科研协作 组研究的资料， 1976 1987 年我国 25 个省 (市 )、自治区共测定 13000 余个稻瘟病菌株，鉴定出 8 群 85 个生理小种，除 “ 全国稻瘟病菌生理小种联合试验组 ” 已报道的 43 个小种外，又新增加 42 个小种 21。日本根据 基因对基因学说 22，通过对水稻品种进行抗病性分析，于 1976 年建立了一套具有已知抗病 “ 单基因 ” 的 9 个粳型品种组成的鉴别品系 23。中国农科院作物所采用近等位基因系的育成及 将 其 用于 稻瘟病生理小种 的 鉴别，也取得了一定的进展24。但是，迄今为止，国际上还没有一套鉴别品种适合于世界各稻区 共同利用。同时随着参试菌株的增多，各国发现的生理小种数也在不断增加 25。 （ 2）较高的变异能力。关于稻瘟病的变异能力，曾有很多报道。有人认为，菌株的生理小种是极不稳定的。 曾报道过在菲律宾采集的生理小种多达 250 个，而且不稳定，可以继续分化成大量新的生理小种 26。单个病斑上分离的单孢菌株的致病性也不相同；菌株继代培养也可改变致病力 27。不过，也有人报道生理小种是相对稳定的。大部分生理小种继代培养了 10 20 年后仍然保存了原有的产孢能力，生长特性以及致病力 28, 29。 对 研究过的菌株 进行 再鉴定，结果与原来的结论不一致，认为是由于接种的环境条件不稳定影响菌株高度变异 30。国内也有人同意 的观点， 但 关于稻瘟病菌群体多样性和易于发生变异的 性质 ，所有稻瘟病专家 是认同的 ，并对其变异机制进行了广泛的研究 31。有人认为寄主的定向选择对稻瘟病菌的进化作用最大，这也是抗性品种为什么最终会丧失抗性的一个重要原因 31, 32。 （ 3）特异的侵染途径。稻瘟病菌的孢子是主要的侵染器官，孢子成熟后产生芽管，附着胞附在表面，芽管从自然孔口或以侵染栓从表皮直接进入。侵入过程 ： 病 菌的分生孢子接触寄主表皮上的机动细胞后，其尖端释放出粘液 (发芽使得孢子紧密地粘着在寄主表面； 芽管继而分化成特殊的侵染机构 附着胞 ( 附着胞产生侵染栓穿透角质层和表皮细胞壁； 病菌分化成次生菌丝在寄主细胞中生长，侵染临近表皮细胞并能深入细胞壁； 5 7 天后出现症状，分生孢子梗分化出大量新的分生孢子并从病斑中释放出来； 这些新形成的分生孢子可重新侵染寄主。后期即以菌丝体和分生孢子在稻草、稻谷上越冬，完成侵染循环。其中，附着胞的形成是成功侵入的 关键步骤之一，它必须产生足够的压力才能够机械穿透寄主角质层完成侵入过中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 程，而黑色素就是产生附着胞压力的前提，附着胞与寄主表面接触一侧非常小的区域内沉积黑色素，最后形附着胞孔，完成侵入过程 3336。 用抗病品种防治稻瘟病 选用抗性品种是控制病害的关键，稻瘟病抗性的研究已有很长的历史。国内外学者主要从广谱抗性、田间抗性、垂直抗性、水平抗性、慢瘟性及数量抗性 (部分抗性 )等方面评价品种的抗性 39。我国的育种专家通过对广泛的抗源筛选，选育出一批具有抗多个生理小种的品种 (组合 )。如汕优多系 1 号、冈 优多系 1 号、冈优 22、粳籼 89、优 3 号、 5 号、 7 号，镇稻 2 号、 88 ，有的已成为主栽品种， 为 控制病害 做出了一定的贡献 。同时，筛选出对稻瘟病具有相对持久抗性(10 年以上 )的材料，如二九丰、丙 1067、小粒野生稻、谷梅 2、 3 号等，为抗病育种提供了种质资源。此外，还研究了品种使用技术，明确了抗、感品种合理布局，可有效减轻病害，为科学利用抗性品种提供了依据。 通过传统的杂交育种方法培育一个新 抗病 品种至少需要 7 10 年的时间，而一个抗病品种种植 3 5 年往往又会随着稻瘟病菌群内新的生理小种的出现或是原生理小 种致病性的变化而使其抗性丧失 40。并且一个抗性品种一般只能对几个稻瘟病生理小种表现出高度抗性，同时水稻从苗期到成熟期的各个阶段都能发病，抗叶瘟的品种不一定能抗穗瘟，反过来也是如此。现代生物技术育种给人们带来了希望，但目前没有多少成功的例子，要想成为主流还需要一定的时间。因而近年来，植物病理学家在尝试利用水稻品种多样性来解决这一问题，并且取得了一定的成绩 41。 用化学农药防治稻瘟病 防治稻瘟病过去的常用药剂有稻瘟净、异稻瘟净、克瘟散等，目前北方地区多在使用的有：施保克乳油、多菌灵微粒剂、 多菌灵胶悬剂、多菌灵可湿性粉剂、 三环唑、比艳可湿性粉剂、富士一号乳油等。南方稻区常用的化学防治主要有：三环唑可湿性粉剂、稻瘟灵（富士一号）乳油、多菌灵可湿性粉剂等。富士一号（稻瘟灵）和三环唑是从八十年代开始推广的。近年的研究表明，众多药剂中，三环唑最好，对稻瘟病防治效果在 90%以上 42。三环唑的作用机理主要是通过抑制病原菌体黑色素合成而不能形成附着胞阻止病菌侵入 43。江苏省通州植保站采用 雷霉素加四氯胶悬剂 1500 倍对水稻叶瘟病的防效达 90%以上，对穗瘟病的防效达 80%左右，与三环唑的效 果相仿，增产作用明显，优于三环唑。除此之外，还研制出对苗、叶瘟有良好防效的种子处理剂，如水稻水育秧和旱育秧种衣剂，播种后 30 天防治叶瘟效果为 比对照三环唑浸种(提高防效 基本上控制了苗床死苗问题。复配剂也有发展，比如加收热比、瘟克、施稻灵等。 虽然化学防治增加 水稻 种植成本，但是当稻瘟病大发生和流行的时候，施用防治稻瘟病的农药目前还是必不可少的措施，是保证水稻丰收的必要条件。目前这些药剂虽然防治效果较好，可是容易使病菌产生抗药性。最近浙江报道，发现该菌有些生理小种对三环唑 已产生抗性；而在临海和丽水等地，发现该菌对稻瘟净和异稻瘟净也已产生抗性。更重要的是化学农药不仅会损害人体健康还造成环境污染和生态平衡的破坏，使人类受到更大的威胁。因此，植物病害的生物防治中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 被认为是最具有发展潜力的防治方法，而化学农药的使用会越来越受到限制。 瘟病生物防治研究进展 稻瘟病的生物防治是从 20 世纪 50 年代开始的 44。 70 年代初首先在发达国家广泛开展了综合防治的理论和应用研究，为此 1976 年联合国粮农组织 (专家规范了综合防治的定义，以推动病虫害综合防治在世界范围内的广泛研究 ，并逐步在多种作物上应用，取得了较大进展。近年来国际上在探讨 21 世纪植保科技前景中提出 “ 的新思想，意即生物强化 有害生物 综合治理，其研究内容包含作物抗性、天敌保护利用、栽培制度、生物农药的利用等，使研究工作不断引向深入和实用化。病虫害防治的发展趋势是保护农田生态平衡，以 “ 自然控制 ” 为主，辅之以必要的人工措施，将病虫的损失控制在允许的经济阂值之下。 用微生物农药防治稻瘟病 近年来，对农药的要求除了安全无毒外，还应对环境有较小的选择压力。微生物农药最能体现生物防 治的特点，它的作用靶标或对病原菌的作用一般都是多因子的，或称多效的，故不易使靶标菌产生抗药性。随着人们生活水平的提高，人们对食物的安全性和品质的要求也越来越高，在这种情况下，不仅要求水稻的产量，更要求稻米的质量，因而生物农药的使用是不可缺少的。 （ 1）生防微生物 国外先后研究过的用于稻瘟病的生防微生物包括 44, 46， 47， 48， 93， 47, 50, 51， 52 等。 木霉属 (菌在生物防治中扮演着重要角色。 A 研究报道，一株木霉菌在 28 、 6 条件下，抑制 稻瘟病菌 的效果最佳 53。 等 54的研究也表明，几种木霉属的真菌对 稻瘟病菌 的抗生效果可达 89% 100%，是有开发应用价值的生物防治真菌。 是真菌 生的一种新的几丁质酶合成 抑制剂，其分子量为 358 子式为 化合物对 稻瘟病菌 有强抑制活性 55。放线菌也是人们研究的重点对象， 得了 5 株放线菌，其发酵物对稻瘟病菌分生孢子的萌发、生长和附着孢的产生有较强抑制作用，其中 菌株的发酵液能显著减少温室的叶瘟病斑 56。据报道，来自 96一种新的环肽抗生素 稻瘟病菌有效 57。 目前 对拮抗菌的研究主要集中在抗稻瘟病菌菌株的分离和筛选以及拮抗物质的提取及活性的研究上。在利用拮抗作用这一生防机理筛选拮抗物质或其它生理活性物质时，以前多以放线菌为主要对象，后来，越来越多的科研工作者把目光转向了细菌。用细菌作为拮抗菌来防治植物病害有着很多优势，如种类多存在广、繁殖快、易培养、抗逆性强、作用方式广等 58。对稻瘟病菌有明显抑制作用的生防细菌多为芽孢杆菌 (假单胞杆菌 (59，近年来对这两种菌的研究占有相当大的比例，并筛选出了一些有生 防潜力的菌株 45, 60。芽孢杆菌中用于防治稻瘟病的主要有枯草芽孢杆菌 (B. 短小芽孢杆菌 (B. 蜡状芽孢杆菌 (B. 。 日本学者在将 株用于稻瘟病的防治研究中，经两年的室内拮抗测定及田中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 间防治试验，发现其对稻瘟病菌的生长、孢子萌发及附着孢的形成都有极强的抑制作用。用1108 5108菌悬浮液，田间防治效果分别为 但对病斑的治疗和控制效果不佳 60。此菌作为稻瘟病 的防治产品，值得进一步研究。 陈卫良等从水稻叶围分离得到的 B. 30 菌株，对稻瘟病菌有很好的抑制效果，同时还对水稻白叶枯病、纹枯病、恶苗病等多种病原真菌、病原细菌具有拮抗作用，表现出广谱抗性 61。游春平等发现一株短小芽孢杆菌，其发酵液稀释 100 倍后还可对稻瘟病菌的孢子萌发有明显的抑制效果（ 97%），比枯草芽孢杆菌还高（ 62, 63。彭化贤等，从水稻作物根际分离筛选得到一株蜡状芽孢杆菌 一株枯草芽孢杆菌 连续两年分别在室内和田间进行稻瘟病防治实验， 其防效可达 50%以上， 有较好的促生效果 64。 国内近几年得到了一些在抑菌能力上较好的菌株，但 其 离应用尚须时日。如 株（ B. 离体条件下及温室中对稻瘟病菌有很强抑制作用，同时在离体条件下对其它几种主要的水稻病原菌也有很强的抑制作用，表现出很好的广谱抗性。然而，在相同的浓度下， 株与国外 深入 研究的 株 (P. 比，在水稻植株上的定殖能力较弱 65，田间效果差。 假单胞杆菌用于稻瘟病的防治主要有荧光假单胞杆菌（ P. 66、恶臭假单胞杆菌（ P. 67等。国外近几年研究得比较深入，不但选育出如 P. 7种 既强烈抑制稻瘟病菌又对其它多种病害有效的高效菌株，而且以其作为基因工程菌进行研究，取得了一定的成果 68，而我国在此方面的研究才刚刚起步。通过分步筛选，林福呈等获得 2 株假单胞杆菌，对稻瘟病菌孢子芽管生长和附着胞形成有抑制作用，初步鉴定为 ： P. 在离体条件 下，对叶瘟的防治效果分别为 和 69。肖炎农等也得到一株假单胞杆菌 稻瘟病菌孢子萌发和菌丝生长有很强的抑制作用，田间防效也达到 45%左右 70，这与 株 71在室外的防治效果相当。另外 株发酵液的抑菌活性有良好的热稳定性和耐稀释性能 70。国内也有人对假单胞菌株 泌铁载体与抑菌活性的关系进行了研究，发现 株在无铁条件下分泌的铁载体，能在低铁条件下抑制稻瘟病菌的生长，说明抑菌作用的发生与铁载体有关 72。 （ 2）农用抗生素 灭瘟素 又叫 “ 稻瘟散 ” 、 “ 勃拉益斯 ” ，是一种从放线菌培养液中提取出来的抗生素， 1958 年由 人首先分离得到，并在 1961 年大面积应用于稻瘟病的防治 73，它是第一个广泛应用的农用抗生素，对稻瘟病菌引起水稻苗瘟、叶瘟、穗颈瘟等都有很高的治疗效果。我 国 在 1959 年 从 广 东 花 县 土 壤 中 也 分 离 到 一 株 灰 色 产 色 链 霉 菌 (产生灭瘟素 的