【毕业学位论文】（Word原稿）中国绵羊核心种质构建方法的初步研究动物遗传育种与繁殖硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 中国绵羊核心种质构建方法的初步研究 o： I 摘 要 绵羊品种资源是 一种可更新的生物遗传资源， 是维持人类生存、维护国家生态安全的物质基础，是持续发展我国养羊业生 产和改善人民生活的重要生产资料和生活资料。正确认识我国绵羊地方品种资源的地位和作用， 确定我国地方绵羊品种中具有特殊遗传和开发利用价值的群体， 加强对地方品种中特异基因资源的发掘、定位和创新利用是解决如何将我国的绵羊资源优势转变为技术优势和产品优势这一重大问题的基础，也是在传统育种工作的基础上开展 分子标记辅助 育种和品种分子 设计 的前提。 本文提出了中国绵羊核心种质的构建策略并对其可行性进行了研究。在已有资料的基础上以 33 个中国地方绵羊品种为总体，以系统的观点，采用统计学的方法结合起源，形态特征，地理分布和分子生物 学的信息构建了中国绵羊的次级核心种质并对它的代表性进行了检验。 主要的研究结果如下： 1. 根据地理分布信息、形态信息从 33 个地方绵羊品种中选取 6 个绵羊品种： 大尾寒羊 (湖羊 (腾冲羊 (乌珠穆沁羊 (哈萨克羊 (藏羊 (构建了中国绵羊品种资源的初级核心种质。 2. 用 31 对 物对 6个地方绵羊品种进行遗传多样性分析。共检测到 326个等位基因，每个位点的等位基因数在 6均等位基因数为 间，平均为 明中国绵羊初级核心种质的遗传多样性较高。 3. 根据地理分布特征、形态特征和分子标记特征对 6个地方绵羊品种进行聚类分析。以距离系数 10为标准，将 6个中国地方绵羊品种分为类。 4. 初步选取了大尾寒羊 (湖羊 (乌珠穆沁羊 (哈萨克羊 ( 个绵羊品种作为次级核心种质，通过对核心种质的检验，证明了已构建的核心种质具有较好的代表性。 5. 采用 地理分布信息和形态信息进行初步聚类分析， 以合理的取样方法及取样比例选取初级核心群体，应用 平的 据进行再次聚类，可以构建出具有最大遗 传多样性代表性的绵羊核心种质。 关键词 ： 中国绵羊 ， 核心种质 , 微卫星 he a a of of in of to of In we of to to 4 as 3 of as 1. of by 2. 31 to A 26 of 7( IC( of 3. 33 on 4. as of 5. in SR to we of by 录 第一章 绪 论 . 5 . 5 . 5 . 6 . 7 . 9 机保种理论 . 9 . 10 . 10 . 10 国绵羊生态类型多样化 . 11 . 12 羊核心种质 . 12 . 12 . 13 . 13 . 14 . 15 . 16 . 16 . 16 第二章 材料与方法 . 17 . 17 . 17 . 17 . 18 . 18 . 19 . 19 . 19 . 19 . 20 . 20 . 21 . 21 . 24 第三章 结果与分析 . 25 . 25 . 25 . 25 . 26 . 26 . 27 . 27 . 27 . 28 . 28 . 30 . 31 析 . 32 . 33 . 36 . 37 . 38 第四章 讨 论 . 40 . 40 . 40 . 41 . 41 第五章 结 论 . 43 结论 . 43 . 43 参考文献 . 44 附 录 . 49 致 谢 . 56 个人简历 . 57 中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 5 第一章 绪 论 传多样性的概念及其意义 生物多样性（ 单地说是生命有机体及其借以存在的生态复合体的多样性和变异性（ ,1990）。确 切地说，生物多样性是所有生物种内遗传变异和他们的生存环境的总称。包括所有不同种类的动物、植物和微生物，以及它们所拥有的基因，它们与生存环境所组成的生态系统（汪松，陈灵芝， 1990）。因此，生物多样性包括 4 个层次，即遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性。生物多样性是人类赖以生存的各种生命资源的总汇和未来工农业、医药业发展的基础，为人类提供了食物、能源、材料等基本需求，同时生物多样性对于维持生态平衡、稳定环境具有关键性作用，为全人类带来了难以估计的利益。生物多样性的存在使人类有可能多方面、多层次地 持续利用，甚至改造这个生机勃勃的生命世界。 丧失生物多样性必然引起人类生存与发展的根本危机。脊椎动物中的生存期一般认为是500万年，在过去上亿年中，自然灭绝速率不断加快，现在的灭绝速率是地球史上最高的（ 988） ,为自然灭绝速度的 1000 倍！中国是世界上少数几个“生物多样性特别丰富的国家 ” （ 一，物种数约占世界总数的 10%。但现在中国有 15%物种受到严重威胁，在濒危野生动植物国际贸易公约列出的 640个世界性濒危物种中，中国占 156种，约为总数的四分之一。面临日益严重的物种丧失和生态环境破坏，人们越来越重视生物多样性保护。世界观察研究所（ 国际保护自然和自然资源联盟（ 联合国环境项目（ 1991 年发布了生物多样性现状报告，起草了生物多样性保护战略和保护生物多样性的十年行动计划。生物多样性保护已成为国际关注的全球热点问题之一。 遗传多样性（ 生物多样性的重要组成部分。广义的遗传多样性是指地球上的所有生物携带的遗传信息的总和，蕴藏在动植物和微生物个体的基因里。通常谈及生态 系统多样性或物种多样性时也就包含了各自的遗传多样性。狭义的遗传多样性主要是指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异的总和。遗传信息储存在染色体和细胞器基因组的 列中。虽然动植物和其他生物一样都能准确的复制自己的遗传物质 自己的遗传信息代代相传，以保持遗传性状的稳定性。但有许多因素能影响 些影响因素有的是来自外界的，有的是本身的。可能引起的变化也是多种多样的，小的可能是一个碱基对的变化，大的可能由于 位、缺失或转座而引起多个碱基对的改变，从而导致不同 程度的遗传变异。随着遗传变异的不断积累，遗传多样性的内容也就不断地得到丰富。一个物种的遗传变异愈丰富，对环境变换的适应性就愈强。反之，遗传多样性贫乏的物种，通常在进化上的适应性就弱。也就是说群体内的遗传变异反映了物中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 6 种的进化潜力。 长期以来人们早就知道地球上生命的多样性和持续性。动植物分类学上地理族（宗）、亚种的划分；农业上家养动物和农作物品种、品系或类型的划分也就说明了这一点。只是以往的认识多来自外表形态、地理分布、生态学以及生产性状等方面的资料。动植物的形态及表型是遗传和环境相互作用的综合结果。表型的多样 性并不能完全真实地反映遗传的多样性，因此今天谈动植物的遗传多样性应更多地关心遗传信息或遗传物质载体 染色体数目、形态、行为即核型的多样性，甚至基因本身，即 国家养动物遗传多样性研究的重要性和必要性 家养动物不仅为当今人类生活提供了重要的动物性蛋白质，而且在人类社会发展过程中，在狩猎、运输等多方面都起过重要的作用。家养动物的多样性是生物多样性的重要组成部分，并在遗传多样性中具有特殊地位。 中国有着悠久的历史和古老的文明，我们的祖先留给我们许多优良的独特地方品种。特别是西部地 区，由于历史上交通闭塞，少数民族社会经济和文化发展的缓慢，迄今还保留了不少耐粗放饲养管理、抗逆性强、可适应社会多种需要的品种和类型。据 20 世纪 80年代调查表明，我国传统的家养动物（畜禽）品种、品种群及其类群共计 596个，列入中国各畜禽品种志的品种 280 个，包括地方品种 194 个，培育品种 44个，引入品种 42个。据近来有关报道，我国家养动物现有品种和类群 1943 个，其中马 66个，驴 22个，牛 73个，水牛 20个，牦牛 5 个，绵羊 79个，山羊 48个，猪 113 个，鸡 109个，鸭 35个，鹅 21 个，火鸡 3个，兔 14个。截止 1989 年，我国先后从世界上 20多个国家（地区）引进了畜禽品种 120余个，其中牛 29个，绵羊 25个，山羊（奶山羊、毛用山羊） 4个，猪 11个，家禽（不包括配套系）品种 39个（郑丕留等， 1986维祺， 1996；陈幼春， 1998）。引入的良种家养动物不仅丰富了中国家养动物品种资源，也对改良中国低产家养动物品种起了积极的作用。中国家养动物的遗传多样性为遗传育种提供了宝贵的遗传资源，这不仅是中国而且也是世界动物遗传资源宝库的重要组成部分，已经能够引起国际社会的浓厚兴趣。但是随着社会经济发展和科学技术的进 步，如冷冻精液和人工授精、胚胎分割、胚胎移植等育种技术的应用，以及对畜禽经济性能的盲目追求，导致中国家养动物的遗传多样性已经或正在发生深刻的变化。某些地方品种的群体数量急剧下降，甚至灭绝。 当前国外畜种遗传多样性日趋缩小，畜种资源日趋贫乏、单调。中国家养动物的丰富遗传多样性及其特殊的遗传基础就更具有吸引力。中国家养动物正面临特有的遗传多样性迅速缩小的危险，无论是从保护中国古老文明的遗产或是保护特有基因，还是随着社会发展需要保存一些符合未来需求的基因角度，我国固有畜禽遗传多样性的保护都是一项紧迫的任务。许多学 者认为，家养动物遗传多样性的丢失比野生物种多样性的丢失对人类利益损害更大，因为家畜（禽）是人类主要的生产资料，是人类长期选择的产物（马月辉等， 1999；冯维祺， 1996）。品种是家禽（畜）多样性的特殊形式。我国家养动物遗传资源保护远没有野生动植物保护那样受到重视。对家养动物遗传资源研究不够，大多数畜种没有进行系统的起源、分类、遗传关系的研究，造成没有足够依据对家养动物进行保护和开发。中国家养动物品种间和品种内的遗传多样性，特别是细胞和分子水平上的多样性研究是一个薄弱的环节。因此，研究家养动物的起源及遗传多中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 7 样 性，不仅是现代动物遗传育种和畜牧业的发展的基础，也是为了适应未来人类需求的变化培育相应的品种做准备。特别是随着当代生物技术的迅猛发展，基因转移技术的日益成熟，这种研究更具现实意义。 传多样性研究的原理和方法 在研究家养动物的遗传多样性时，通常首先考虑种内或种以下的分类阶元，即亚种间或亚种内、群体间或群体内丰富的遗传变异。种内的遗传变异或遗传多样性即遗传学中所说的多态性，它包括外部形态（表型） 、 染色体水平、酶和蛋白质以及核酸水平的多态等方面。遗传多样性的监测方法也多种多样，不同的技术、方法从不同 的角度、不同层次揭示了物种的遗传背景信息。 从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老，最简便易行的方法。形态学水平的方法就是采用生物体的某些特定的，肉眼可见的或可度量的外部特征，如毛色、体尺、体重等形态或表型性状来检测的方法。通常利用的表型性状主要有两类：符合孟德尔遗传规律的质量性状和多基因决定的数量性状。通过种群间和种群内体型外貌的比较研究可为探讨物种起源和分类提供有意义的提示和依据。这种遗传多样性可能是由于遗传起源、生态环境、社会经济条件、选育方法的不同形成的。例如，我国绵羊尾型 有肥臀尾，短瘦尾，长瘦尾，脂尾之分。在毛色的遗传变异上 ,由于选育方法的不同 ,有黑、白、棕红色三种毛色。畜禽品种体型外貌的这些多态性 ,在一定程度上反映了品种的形成历史和选育程度。 蛋白水平上检测遗传多样性主要包括检测血型、蛋白质、同工酶的基因座位的多态性。血液蛋白多态性是指功能相同的血液蛋白质或酶存在两种以上的遗传变异 ,该变异可作为一个遗传标记因子来反映动物个体的遗传变异情况。同工酶是指具有同一底物专一性的不同形式的酶，其具有组织，发育以及物种的特异性。根据畜种的蛋白多态程度 ,可推测其遗 传背景。兰蓉等 对来自德钦县、巧家县、腾冲县的绵羊进行了 34 个同功酶及血液蛋白的研究， 表明云南不同地区绵羊在蛋白水平上遗传多样性较为丰富。 聚类分析结果显示 ,云南绵羊起源于同一共同祖先 ,与印度绵羊、尼泊尔绵羊关系较近 ,而与西藏绵羊关系较远。 细胞水平的遗传变异产生于染色体的遗传变异。染色体变异主要表现为染色体组型特征的变异 ,包括染色体数目变异 (整倍体、非整倍体 )和染色体结构变异 (缺失、易位、倒位、重复 )。兰蓉等对云南昭通，德钦，腾冲绵羊染色体的核型， G 带， C 带， 结果反映出云南绵羊在进化过程中有不同的分化。另外 ,染色体水平上的多样性还体现在染色体的形态、缢痕和随体等核型特征上。随着染色体研究技术的发展 ,如细胞原位杂交技术的应用 ,在染色体上将揭示出更加丰富的遗传多样性 ,这为研究中国畜禽的起源、演化和分类 ,以及开展标记辅助选择提供了依据。 中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 8 近二十年来 ,随着分子生物学技术的快速发展 ,平上的多态性已为人们所熟知。 遗传多样性产生于 苷酸序列的差异，包括基因组编码区或非编码区，保守区或高变区，核 细胞质 差异。畜禽品种在核 线粒体可呈现不同的多态性 ,对于了解畜禽的起源、遗传分化和群体间的亲缘关系以及合理利用和保护畜禽品种资源具有十分重要的意义。 第一代分子标记 : 第一代分子标记以电泳和分子杂交为核心，代表性的标记有： 通常用 或非放射性物质 (如地高辛等 ) 标记探针 ,与转移于支持膜上的总基因组 限制性内切酶消化 )杂交 ,通过显示限制性酶切片段的大小 ,来检测不同遗传位点等位变异 (多态性 )的一种技 术。用作 针 (即互补 用 模板通过反转录合成的 与基因组 探针两种。 针的保守性较强是研究作物起源演化的较好探针。但是这类探针检测的多态性频率较低 , 在育种上应用可能会较少。 针是从总基因组 克隆出来的 , 这类探针检测的多态性频率较高 ,但不同种属特异性较强。 它可以区别纯合基因型和杂合基因型 ,能够提供单个位点上的较完整的资料。 遗传 本质是由单碱基的突变或结构重排（插入、转移、倒位等）引起的，它为符合孟德尔遗传的共显性标记，结果稳定可靠，重复性好 ,主要应用于遗传连锁图的绘制和目标基因的标记。但是由于 需要量较大 (5 10需要的仪器设备较多 , 技术也较为复杂 , 因而目前很难直接用于育种。为了解决这一问题 , 1995)提出将 以便在育种上加以利用。 对核 行 析，探讨物种的分类、起源等虽有一些报道，但由于它的操作过程繁杂，因而限制了该技术的应 用。由于动物线粒体 子量小、结构简单，为共价闭环双链 直接酶切进行 析，因此，目前 术的应用较多是对线粒体 已有许多研究报道。 第二代分子标记： 第二代分子标记以电泳和 表性 的标记有 。 微卫星（ 短串联重复 (称为 人类及动植物的基因组中广泛存在的由 1 4 个碱基对组成的简单重复序列 ,如 (GA)n,(AC)n,(n(其 中 n 为重复次数 )等。 具有 以下优点： （ 1） 作为一种高度多态性的分子标记，微卫星 泛存在：人和动物（ n， 植物（ n 中， 具有丰度高、共显性标记、选择中性的特点； （ 2） 微卫星采用单位点指纹技术，检测容易，重复性较好； （ 3） 微卫星扩大了取样范围，减轻了取样工作的困难和对研究对象的影响； （ 4） 微卫星的出现为种群生物学家们提供了空前丰富的遗传信息资料，同时也促进了相应的统计分析方法的发展。 中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 9 目前 记已被广泛用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。与记相比 ,测的 多态性频率要高很多 。 用作探针外 ,还可通过 增基因组中所含的重复序列区域 ,因此它具有 法的优点。但是要克隆足够数量的 对其进行测序和设计引物 ,没有足够的投资、人力和时间 ,是不可能实现的。 第三代分子标记： G 998年建立的，它是由于基因组核苷酸的变异引起的 ,这种变异通常可由单个碱基的转换或颠换所引起。从理论上讲 ,也可能是 3个或 4个等位多态性 (1998)。 种形式 ,其中 C/T(G/A)转换最常见 ,约占 2/3,其余 3种颠换为 C/A(G/T)、 C/G(G/C)和 T/A(A/T),发生几率相似 (999)。根据其在基因组内的位置可将 种 :基因编码区的功能性突变 ,主要分布在基因编码区 ,称为 这类 大概只有 1%的 遍布于全身的大量的碱基变异 (李艳杰等 ,2003)。根据其对生物的遗传性状的影响来看 ,种 :突变 碱基与未突变碱基的含义相同 ； 碱基序列的改变可使翻译的蛋白质改变 ,从而影响了蛋白质的功能 ,这种改变常是导致生物性状改变的直接原因 (杜玮南等 ,2000； 003)。而非编码区中出现在基因表达调控区的 能会影响基因的表达调控 因芯片技术，同源杂交，限制性酶切法，直接测序法。 (1) 分布广泛 ,密度高 在数量最多的一种遗传多态性。 (2) 富有代表性 某些 接影响蛋白质结构或表达水平 ,因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素。 (3) 遗传稳定性 尤其处于编码区的 高度稳定的 ； 因此在遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于 (4) 通量检出 ,易实现分析的自动化。 由于具备上述优点 , 代限制性片段多态标记、第 二 代微卫星多态标记之后的第 三 代基因作图标记 (杨昭庆等 ,2000)。 机保种理论 现有的随机 保种理论是建立于群体遗传学理论基础上的，其目标是长时间的维持群体遗传结构的平衡，即使保种群始终维持 H 基 因频率和基因型频率代代不变，则保种工作有效。它最终目标是原封不动的保存品种所有的 基因而不使丢失。 群体遗传学认为影响群体基因频率改变的主要因素有突变、选择、迁移、遗传漂变和近交。 随机保种理论的中心即是控制群体近交系数的上升，尽量避免群体中的任何基因由于随机漂 变而丢失。由于影响漂变和影响近交的效果基本相同，其关键是影响了群体的有效含量。据此 可采用中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 10 以下措施： (1)使保种畜群中公母数尽可能相等或保 持适当的公母比例以增加群体的有效含量，减少遗传漂变的影响。 (2)尽可能避免保种群内近交系数上升减慢基因的纯合速度。 (3)建立专用的保种场，实行随机交配及家系等量留种，避免选择，应用现代技术延 长世代间隔。 随机保种理论的优缺点： (1)随机保种理论目标是在有限的群体中原封不动地保存基因库中的每个基因，根据前述的理论依据这是很难实现的。 (2)随机保种理论为每一品种设立保种群使许多特性在品种间重复保存，浪费人力财力。 (3)随机保种最大的缺点是保种与选育之间矛盾突出，与我国地方品种的选育实践在目的、方法等方 面都是不相容或背道而驰的。 (4)随机保种理论使全部位点上的基因都能得到一定概率的保存，这对于满足将来的育种工作似乎较为有利 。 统保种理论 盛志廉（ 1989）认为，随机保种理论不适合中国国情，也不适合世界大多数国家的国情，从而提出了将保种工作视为一个整体系统工程的系统保种理论：以系统观点为核心，已具有遗传特性为目标，结合品种选育为主要手段。此后杜立新（ 1992）、张志武（ 1993）、芒来（ 1993）、陈瑶生（ 1995）等从不同角度对这个理论进行了研究。 这个理论存在的主要问题是： (1)在以畜禽保种 的条件下，没有游离于具体品种的性状； (2)不同品种的相同性状不一定由同一基因型（或数量性状基因群）控制，保护品种的省略可能导致有利基因的重大损失； (3)许多表型上难以看到的性状，如抗病性状可能被忽视； (4)小群体的近交速率仍无法控制； (5)遗传力低的性状，如繁殖性状，无法选择。 当代畜禽遗传资源保护 ,从本质上应包括以下 3个部分 :保持各位 点的基因种类 ;保持基因组合体系 ;保持特定位点的基因纯合态以及基因组合体系的稳定性。 总之，无论哪种保种理论都要保持群体遗传结构的相对稳定，保持基因频率平衡 (杜立新，1992),否则将使群体结构遭到破坏。 国绵羊起源的多样性 绵羊（ 是人类早期驯化的动物之一。系统分类学上，绵羊属于偶蹄目（ 、牛科（也称洞角科， 山羊亚科（ 、绵羊属（ 表 分的体系为标准对绵羊属动物的分类，中文名参照中国羊品种志。 中国农业科学院硕士学位论文 第 一 章 绪论 11 1914）通过对中国内蒙古地区脂尾绵羊与内地绵羊颅骨的比较，认为中国绵羊至少可分为两种类型，一种与 盘羊一致，一种与赤盘羊一致。张仲葛（ 1953）、谢成侠（ 1985）则认为赤盘羊和盘羊及其若干亚种与中国现代家绵羊有血缘关系。冯维祺（ 1991）根据中国考古发掘，从分布于内蒙古地区的蒙古羊与分布于青藏地区的西藏羊彼此间在头型、角型、体型外貌的不一致现象推断中国绵羊的起源仍可追溯到赤盘羊与盘羊两种类型，同时指出中国不同地区的野生盘羊就是家绵羊的始祖。李志农（ 1993）明确指出中国家绵羊源于盘羊的蒙古亚种和西藏亚种。 我国地方绵羊品种在起源系统方面具有很大优势，具体表现在以下两个方面。我国地方绵羊品种在物种层次上 起源是多元的，众多地方品种与目前几乎遍布全球的欧美