【毕业学位论文】（Word原稿）大豆子叶异黄酮类次生代谢物的诱导及其微粒体部分蛋白的初步研究生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大豆子叶 异黄酮类次生代谢物的诱导 及其微粒体部分蛋白的初步研究 of in of of in of I 摘 要 大豆 L.) 不仅可提供优质丰富的蛋白质和油脂，更是具有多 种生物活性的异黄酮类化合物的重要来源 。 大豆 应激反应的 主要产物，同时，它也是一种异戊二烯化的异黄酮，这类化合物 生物学作用 的日显突出和其分布的局限性吸引着越来越多研究者的 关注 。 本研究综合利用分析高效液相色谱、制备高效液相色谱、同位素标记、薄层色谱、四极杆 S/二维电泳等现代 技术，将分析化学、制备化学、蛋白质分离纯化和 氨基酸序列 测定充分结合 ，研究了外源硝酸银和茉莉酸诱导处理中黄 13 号和“ ”（荷兰）大豆子叶后， 其前体 诱导累积规律及其与其它固有的大豆异黄酮之间的联系；同时，对大豆中的异戊二烯转移酶进行了活性测定；并对硝酸银诱导后大豆子叶微粒体蛋白进行了初步研究。主要结论如下： 1、 中黄 13 号与 对 外来刺激产生应激反应的能力 有所 不同 ， 与 相比，中黄 13 号 对外界刺激更为敏感。 2、硝酸银诱导处理后， 构体比例不随 保温时间 的延长而改变；大豆苷元和染料木素含量上升，其相应的糖苷含量下降。茉莉酸 处理后 ， 和 占比例下降， I 所占比例增加 ；同时，游离苷元含量下降，糖苷含量增加。这表明：虽然硝酸银和茉莉酸都能够诱导大豆子叶中 累积，但是，其作用机制有可能不同。 硝酸银 诱导 积的能力最强，其次依次为 和 硝酸银。10 导 积的能力最强， 20 M100 M 的茉莉酸诱导 积的能力相近 ， 1 浓度 的茉莉酸非 但 未 能 增强 诱导 积的 能力 ，反而 有可能 在某种程度上抑制了 累积 。 3、在 积过程中，苯丙氨酸代谢途径中的相关化合物在发生物质转化的同时，还发生着空间上的转移。植物抗毒素 累积只发生在遭遇刺激的部位 ；同时，该部位中与之有关的其它异黄酮浓度也高于健康部位。另外，这些化合物还存在着从健康部位向遭遇刺激部位转移的倾向，且与遭遇刺激部位垂直相连的部位有可能比与之横向相连的部位更容易与受刺激部位发生异 黄酮间的转运和交换。 4、利用制备高效液相色谱， 从 390g（ 鲜重 ） 硝酸银 诱导 的大豆子叶中 分离 纯化出 约110纯度的 282 g/g 鲜重 ） ， 为大豆中 异戊二烯 转移酶的研究提供了 难得 的底物 ，并 提供了一种 分离纯化 有 效方法 。 5、利用 3H 底物进行大豆中异戊二烯转移酶活性测定。用同位素标记与薄层色谱相结合，检验并分离、制备反应产物，经 S 分析鉴定，反应产物为 中对 以大量 累积的问题进行了初步分析。大豆中异戊二烯转移酶活性的成功测定为该酶的进一步研究提供了可靠保证，同时也有利于其它与之相关的微粒体蛋白的研究。 6、对二维电泳技术用于硝酸银诱导后大豆子叶微粒体膜蛋白分离的条件进行了优化。结果表明：在重新水化溶液组成中，还原剂比去垢剂对膜蛋白溶解性的影响更大，还原剂三丁基膦比二硫苏糖醇效果好，去垢剂 (3-(4对 蛋 白 质 的 增 溶 作 用 强 于 和 -(31由硫脲、尿素、去垢剂还原剂三丁基膦构成的重新水化溶液（ 较适合大豆子叶微粒体膜蛋白的溶解。本研究的最佳操作条件确定为： 重新水化溶液，加样量为 80g，等电聚焦 20,000（适用于 703条）。 7、二维电泳结果表明：总体来看，对照样品中蛋白量 总量多于诱导样品，大部分大豆子叶微粒体蛋白的等电点位于 。总共发现 14 个由硝酸银诱导而产生的点，其中，在 范围内发现 4 个，在 范围内有 10 个。在 0 范围内，未发现只存在于诱导样品而不存在于对照样品的蛋白质点。 8、四极杆 S/定和氨基酸序列分析表明：硝酸银处理可以诱导大豆 蛋白酶抑制剂（ 其 5亚基和诱导蛋白“ 产生。 本 研究结果对于 调控 大豆中 异戊二烯 化 黄酮 类化合物的 合成 、深入了解 大 豆 “代谢网”、 探讨激发子的作用机理、 研究微粒体诱导蛋白、实施大豆 次生代谢 物 调控和性状的定向改变 等工作具有重要的理论和实践指导意义，必将推动这些工作的顺利进行，从而有助于 利用分子生物学和基因工程手段改善 和提高 大豆的有益性状 ， 使大豆 能够 为人类提供更多的健康植物化合物(最终将在更大程度上有助于大豆各方面价值的 大幅度 提升。 关键词：大豆，子叶，硝酸银，茉莉酸，诱导， 豆异黄酮 L.) us is an of a of As of in is of In we as S/MS D to of by o. 13 . At of in a on of as 1. to . 2. In as of t of of In of II of I in At of of It to of 0 M to be to of 3. of in to of in of of to of in is of is a to to of in to in 4. It in At it an of 5. 3H as in of LC as S/ . of D In 3-(4to of as 7. D of of in to be 6. 6 (4 8 (10 in no in 10. 8. S/MS of V 目 录 第一章 引言 . 1 豆中的黄酮类化合物 . 1 酮类化合物的基本结构和分类 . 1 酮类化合物 在植物类群中 的分布 . 1 黄酮类化合物 . 1 戊二烯化黄酮类化合物 . 7 豆中的异戊二烯化异黄酮 . 9 发现及其基本性质 . 9 生物学作用 . 11 生物合成 . 11 诱导与累积 . 13 豆中的异戊二烯转移酶 . 25 戊二烯转移酶 . 25 物合成中的其它酶的研究进展概述 . 30 白质分离中的二维电泳技术 . 31 维电泳技术的发展与应用 . 31 维电泳技术分离膜蛋白 . 32 响二维电泳效果的其它因素 . 34 维电泳技术应用进展 . 35 研究的目的和意义 . 36 第二章 大豆中 诱导 . 38 料与方法 . 38 验材料 . 38 验方法 . 38 果与分析 . 40 发子浓度对 其它大豆异黄酮的影响 . 40 酸 银和茉莉酸诱导处理后 其它大豆异黄酮在子叶中的分布 . 49 论与结论 . 51 发子对 积的诱导 . 51 同品种的大豆产生 情况不同 . 52 豆 代谢网 . 53 论 . 54 第三章 制备 . 55 料与方法 . 55 验材料 . 55 试验方法 . 57 果与分析 . 57 备高效液相色谱流动相的选择 . 57 分离纯化 . 58 鉴定 . 59 论与结论 . 61 第四章 异戊二烯转移酶活性的测定 . 62 料与方法 . 62 验材料 . 62 验方法 . 62 果与分析 . 64 豆子叶中的异戊二烯化反应 . 64 豆子叶异戊二烯转移酶反应产物的制备和鉴定 . 66 于 积的探讨 . 68 论 . 68 第五章 硝酸银诱导的大豆子叶微粒体蛋白初步研究 . 69 料与方法 . 69 验材料 . 69 验方法 . 70 果与分析 . 72 响大豆子叶微粒体蛋白溶解和 2. 72 酸银诱导的大豆子叶微粒体部分蛋白的 初步 分析 . 76 论与结论 . 80 第六章 结论 . 81 参考文献 . 85 致谢 . 109 作者简历 . 110 格 目 录 表 1见豆科植物中异黄酮含量 . 1豆中主要常见异黄酮 . 1豆中固有的常见异黄酮 糖苷含量 . 1要 大豆 异黄酮生物活性 . 1要异戊二烯化黄酮类化合物 . 1要异戊二烯化黄酮类化合物的植物学分布 . 1. 1豆器官、抗病性以及生长时光照对 积的影响 . 2试所采用的 作系统 . 2 ”和中黄 13 号固有大豆异黄酮含量及分布概况 . 2和硝酸银处理后“ ”和中黄 13 号大豆子叶中异黄酮变化情况 (%). 2莉酸诱导后中黄 13 号大豆子叶中异黄酮分布情况 (%). 2酸银 和 茉莉酸 诱导后 染料木素 在子叶各部 位 的分布和变化 . 3备高效液相色谱 及对应的 分析高效液相色谱 结果 . 4开后各部分 3H放射活性 (. 5同去垢剂组成的重新水化溶液 . 503. 5酸银诱导的大豆子叶微粒体部分经过二维电泳后获得的某些点的等电点 和分子量 . 5部分蛋白质与测定样品匹配情况 . 目 录 图 1酮类化合物的基本结构 及其 分类 . 1酮类化合物的生物合成 . 1豆中主要异黄酮结构式 . 1豆中诱导产生的次生代谢物 . 1生物合成途径 . 1豆中来自前体苯丙氨酸的与防御系统有关的化合物的合成路径 . 2和中黄 13 号大豆子叶的 谱 . 42 图 2酸银浓度对 和中黄 13 号中 积的影响 . 43 图 2酸银浓度和处理后保温时间对 中 构体比例的影响 . 44 图 2酸银浓度和处理后保温时间对中黄 13 号中 构体比例的影响 . 2莉酸浓度和处理后保温时间对中黄 13 号中 构体比例的影响 . 3制备过程 . 3动相组成对 大豆甙流出顺序的影响 . 3备样品与 质谱图谱比较 . 4的点样和区域划分 . 4物合成的最后步骤及异戊 二 烯转移酶催化的反应 . 65 图 4样品 谱 . 5照样品和硝酸银诱导样品使用不同 度胶条的二维电泳图像 . 写 表 分析用高压液相色谱 ) 7 (3-(4 3-(31 界胶束浓度） 3,9 3,9 2 焦磷酸 2 1 法尼焦磷酸 ) 法尼焦磷酸合成酶 ) 牛儿 牻牛儿焦磷酸 ) 牻牛儿焦磷酸合成酶 ) 磷酸类异戊二烯合成酶 ) f. (大雄疫霉大豆专化型 ) 制备高效液相色谱 ) f. 大雄疫霉细胞壁提取的 多糖诱导子 ) 十二烷基硫酸钠 ） (61,6a,9 一异戊二烯焦磷酸合成酶）中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 豆中的 黄酮 类 化合物 酮类化合物的基本结构和分类 黄酮 类 化合物 （ 指两个芳香环 （ 通过 中央三碳原子 连接成的 具有架结构 的 一系列化合物，其基本结构可简单描述为 1 常连 接有酚羟基、甲氧基、甲基、 异戊二烯 基等官能团 或 与糖结合成苷 （程水源 ， 等， 2000；姚新生， 2003； et 1998） 。 该 系列中的 第一个化合物查尔酮（ (图 1 进一步衍生转化构成 各类黄酮 类 化合物 （图 1。根据中央三碳链的氧化程度、 2、 3 或 4 位 ）以及三碳链是否构成环状等特点 (少数情况下，六元杂环 C 发生异构形成开环或被五元环代替，图 1，可将主要的天然黄酮 类 化合物分为 6 类：查尔酮 (黄酮 (黄酮醇 (黄烷酮 (花青苷 ( 异黄酮 类化合物 （ 图 1），其中杂环C 的氧化状态和 B 环的位置在分类中至关重要（ ）。 酮 类 化合物 在植物类群中 的分布 黄酮 类 化合物与类异戊二烯和生物碱一起构成高等植物次生代谢的三大类主要产物，是植物体内多酚类的信号分子及中间体或代谢物，在植物的生长发育、抗病和进 化过程中起着重要作用（ 1996）。 它们 广泛分布于植物界 ， 尤其是高等植物及羊齿类植物中，目前结构已经鉴定的黄酮 类 化合物超过 8000 多种（ 2000）。查尔酮是其他黄酮 类 化合物的直接前体，广泛存在于多种植物体内；黄酮主要存在于草本植物中，如唇形科（ 伞形科（ 菊科（ 及旱芹属（ 的三羟基黄酮（ 和 木贼属（ 的木樨草素（ ； 黄酮醇主要存在于被子植物中，如芸 香（ 荞麦（ 的栎醇