【毕业学位论文】（Word原稿）甘草有益微生物的分离、鉴定及共接种效果初探微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 甘草 有益微生物的分离 、 鉴定 及 共接种效果初探 of of of of I 摘 要 本论文 以 内蒙古和青海省人工栽培的乌拉尔甘草 为材料， 研究 甘草 内生细菌 分布 的多样性 。同时 ， 还对内蒙古栽培甘草的 根瘤菌 和 根 进行了 分析 ， 并 对 内 生细菌、根瘤菌、 根的 共接种 效果进行了初步探讨 ， 结果 如下： 1、 对内蒙 古 一年生、两年生和三年生乌拉尔甘草 、青海 两年生 乌拉尔 甘草 健康植株根、茎、叶等组织中的内生细菌进行了 分离和 数量测定 ，共分离出细菌 146 株。 结果表明 ，甘草根、茎、叶等组织内存在大量内生细菌，不同组织中内生细菌的分布密度不同。 不同 地域、不同 年份甘草组织中内生细菌分布密度也存在较大差异。 通过镜检观察芽孢杆菌是分离的优势菌 ， 约占 30%，实验中还分离到了 黄单孢菌属 ( 假单孢菌属 ( 类芽孢杆菌属（ 及短小杆菌属 ( 采用 析 方法 ， 发现 甘草内生细菌存在特异的扩增条带， 能够分辨出不同 地区 来源、不同组织中 菌株的差异 ， 说明 甘草 中 内生细菌存在着丰富的多样性。 2、 在 板上测定了 146 株内生细菌菌株对西瓜枯萎病 菌 和烟草赤星病菌等 15 种 病原菌的体外拮抗活性。 共有 23 株内生细菌对一种或几种病原菌具有 不同程度的 拮抗活性，其中 6株内生细菌对这些病原菌表现出较好的抑菌活性，对 15 种病原菌的抑制半径几乎都达到了 7别是 黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌的抑制半径都达到了 菌率达到 65%，对病原菌的扩展具有明显的抑制作用。 同时， 株 的 培养滤液 在 板上 抑制 烟草赤星病菌 和 小麦纹枯病 菌的生长， 产生透明的抑菌圈， 这 说明 细菌 在生长代谢过程中产生了具有抑菌活性的抗生物质，抑制了真菌抱子的萌发 。经 常规的生理生化鉴定、 生物自动鉴定系统鉴定 、 16S 列 分析 ， 将 6 株 拮抗菌 分别 鉴定为萎缩芽孢杆菌 (枯草芽孢杆菌 (多粘类芽孢杆菌 ( 3、 从不同年份甘草根瘤中共得 到 54 个根瘤培养物 ，经菌落形态及镜检发现这些菌具有根瘤菌属的特征 。 采用 析方法，发现甘草根瘤菌存在特异的扩增条带，能够分辨出从不同年 份植株上分离的根瘤菌 的差异，说明甘草根瘤菌存在着丰富的多样性。 在用 根瘤菌回接甘草中， 液体培养结瘤数多于半固体培养的，且根瘤较半固体培养的大 。对结瘤效果好的菌株进行克隆测序， 并分析 序列 比对结果， 发现 T)似性都为 99%， 属于中慢生根瘤菌属 。 4、 分离 甘草的 并用三叶草进行 单孢繁殖 ，将繁殖后的菌根回接 甘草。 接种了菌根的甘草植株茎长、根粗、茎叶干重和根干重都有较大程度的提高，均比对照显著增加，并且不同处理对植株生长影响不同。可见接种 将 根瘤菌、内生细菌和菌根共接种甘草，实验结果表明 ， 、钾有明 显的促进作用，三种微生物 接种后 ， 复合接种比单一接种处理植株 根 茎叶中氮、 磷、 钾含量增加。这表明，甘草有益的根瘤菌和内生细菌能增强菌根对植株的促生长作用。 因此，应用三种微生物共接种，对促进甘草生长，提高品质具有潜在的应用价值。 关键词 甘草 内生细菌 根 瘤菌 根 共接种 on of A in go as 146 in of of on of Of 46 6 B. P. of 54 NA of CR of CR in of by to 6of 50 31 in 50 31 9% to 6S of VA by On of of of is by To 、 K 、 K . of to to 、 K VA 录 第一章 绪论 . 1 物有益微生物的作用 . 1 物内生细菌的作用 . 1 瘤菌的应用 . 3 A 菌根的研究与应用 . 4 生细菌、根瘤菌、 根在植物上的相互作用 . 5 物有益微生物研究展望 . 6 草简介 . 6 草的用途 . 6 草的栽培现状 . 7 论依据和研究内容 . 8 论依据 . 8 文研究的内容和技术路线 . 9 第二章 不同地区甘草内生细菌的多样性分析 . 10 验材料 . 10 试甘草 . 10 离和培养用培养基 . 10 验方法 . 10 生细菌的分离和计数 . 10 生细菌多样性分析 . 11 果与分析 . 13 同组织消毒时间的差异 . 13 同组织内生细菌数量的差异 . 13 生细菌的多样性 . 14 论 . 15 第三章 内生拮抗细菌的筛选和鉴定 . 17 验材料 . 17 生细菌 . 17 原真菌 . 17 养基 . 18 验方法 . 18 生细菌体外拮抗作用测定 . 18 内生拮抗细菌滤液对病原菌的抑制作用 . 18 生拮抗细菌的鉴定方法 . 18 果与分析 . 19 生拮抗细菌的筛选结果 . 20 试菌株的培养滤液对病原菌生长的影响 . 21 生拮抗细菌的鉴定结果 . 21 论 . 24 第四章 甘草根瘤菌的 分离 和鉴定 . 25 验材料 . 25 验方法 . 25 瘤菌的分离与纯化 . 25 析根瘤菌的多样性 . 25 瘤 菌的回接方法 . 26 瘤菌的鉴定 . 27 果与分析 . 29 瘤菌的分离结果 . 29 果 . 29 瘤菌的回接结瘤检测结果 . 30 瘤菌的鉴定结果 . 31 论 . 33 第五章 甘草 根的 分离 和共接种 . 34 验材料 . 34 验方法 . 35 A 菌根的分离方 法 . 35 A 菌根的繁殖方法 . 35 A 菌根的回接方法 . 35 接种方法 . 35 A 菌根效果测定方法 . 36 果与分析 . 36 A 菌根的筛选及繁殖结果 . 36 A 菌根的回接效果 . 36 接种效果 . 37 论 . 38 V 第六章 全文结论及展望 . 40 参考文献 . 42 附录 1 实验中所用培养基、试剂的配制以及主要仪器设备 . 48 附录 2 实验图版 . 52 附录 3 部分菌株的 16S 列 . 54 致谢 . 58 作者简历 . 59 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 基对 氧核糖核酸 磷酸脱氧核糖核酸 二胺四乙酸 化乙锭 g 丙基 千碱基对 钟 合酶链式反应 二烷基硫酸钠 醋酸 冲液 （羟甲基）氨基甲烷 g 克 l 升 . 肠杆菌的 微克 t 米 m 性梯度凝胶电泳 in 光原位杂交 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 物有益微生物的作用 据初步研究，在植物体 中 存在的微生物，有益的约为 15%， 有害的约为 15%，表现中性的为70%，但 “益 ”与 “害 ”之间并没有绝对界限。 植物有益内生细菌可以产生促植物生长物质，提高植物固氮性能，促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡 ， 保证寄主植物健康生长。植物根际土壤中的 根能促进植物对 P 等矿质营养和水分的吸收，增强植物的抗性，促进药用植物有效成分的合成，还能减少植物对有毒元素的吸收。根瘤菌具有固氮的功能，帮助植物吸收营养，促进植物的生长 。将这些微生物菌剂应用于 生产 ， 不仅可以增 加植物营养 ， 培肥地力 ， 节约生产成本 ， 而且对农业可持续发展和生态环境的保护起重要作用。 植物有益微生物能单独对植物产生作用，当联合使用时，也对植物产生共促进作用。 下面 简单介绍植物内生细菌、根瘤菌、 们 之间的相互作用。 物内生细菌的作用 植物内生细菌 (指能够定殖在健康植物组织内 ， 并与植物建立和谐联合关系的一类微生物 （ 992） 。内生 细 菌是一个生态学概念 ， 而非分类学单位。在过去的50 多年 ， 人们不断的从植物的根 （ 005） 、茎、叶 （ 001） 和种子 （ 002;2005） 上分离并鉴定出多种微生物 。实验证明， 内生细菌广泛的存在于植物体中，现已 从甘蔗、牧草、水稻 （ 001;001） 、玉米、小麦、高 粱（ 002） ， 以及棕榈树、块根植物 （ 004） 、甘薯、咖啡 树（ 997）、野花（ 006）、西红柿（ 004）、榆树（ 003）等植物中分离到多种内生 细菌 。 随着研究的深入，发现内生细菌具有丰富的次生代谢产物 ， 众多内生细菌活性成分成为新型化合物的一个重要来源和途径，是天然药物的重要 组成 部分 （ 003） 。 有益的内生细菌能产生植物促生物质而促进植物生长 （ 001） ，促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，还可作为潜在生防资源和外源基因载体。 近年来，随着研究领域的拓宽和研究方法的不断改进， 以 及分子生物学技术的发展，植物内生细菌所发挥的重要作用已逐渐被研究者了解，并且引起植物学家、生态学家、微生物学家的极大兴趣 ，已逐渐成为国内外研究的热点。 目前 对内生细菌在植物组织内的生物学作用 机理还没有进行深入的研究，但在实际生产当中 许多内生细菌已作为生物防治剂、固氮菌剂和植物促生剂广泛应用于温室和大田 （ 999） 。 开展植物内生细菌的研究不仅对植物微生物学科的基础研究有重要的理论价值，而且对农业可持续发展也有重要的实践意义。 物防治病原菌 植物内生细菌系统地分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质（碳源、氮源等），同时受到植物组织的保护作用，不受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线、暴风雨等的影响而具有稳定的生态环境，相对于腐生细菌更易于发挥生防作用（ 990）。关于内生细菌作为生防因子的研究很多 ， 并由此开发出一些植物生防菌剂（ 990）。 如有的研究者 从棉花中分离筛选出抗棉花枯萎病的内生细菌菌株 ，用此内生细菌回接棉花 ， 可以减轻人工接种感染的棉花枯萎中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 症（ 995）。傅正擎 （ 1999） 等 采 用棉花内生细菌及其代谢产物与棉花黄萎病菌共培养的方式，证明内生细菌可通过促生长作用来提高棉株的抗逆性， 显示出了良好应用潜力 。 从土豆中分离的内生细菌对轮枝菌、丝核菌、核盘霉、链霉菌、欧文氏菌等都有抑制作用（ 004, 002） 。 从健康柑橘植株中分离的 有抗性 (002)。 从玉米中分离的 内生细菌还能防治玉米病害（ 2004）。 源基因载体 植物内生细菌可作为 外源基因的载体 。将某些杀虫防病基因导入到植物内生细菌中，构建植物内生杀虫或防病工程菌 ， 使植物起到与转基因防病杀虫植物相同或相似的作用（何红 ,2004） ，而植物本身的基因并未发生改变。如将苏云金芽孢杆菌杀虫基因整合到从百慕大草中分 离到的木质棍状杆菌犬齿亚种 (染色体上，建成了工程杀虫细菌，实现了对欧洲玉米螟的生物防治，减少了化学农药的使用，开创了内生细菌作为杀虫基因载体的先例（ 993）。刘云霞（ 1997）等用水稻体内生优势细菌巨大芽孢杆菌 ( 为受体，构建了具有防水稻二化螟活性的工程菌 ， 2000） 等将 因转入分离自苹果苗的内生细菌荧光假单胞菌 (，该带 因的内生细菌对豆苗立枯病 (表现出良好的生防作用。在以内生细菌为载体构建杀虫或防病工程菌时，必须考虑内生细菌本身对寄主植物的作用效果。若以对植物生长有促进作用的内生细菌为载体构建杀虫或防病工程菌可能更有应用价值，对此值得进一步研究。 将基因工程技术运用于 内生细菌能改善环境，在 维持 生态 平衡 方面起重要作用。有报道指出，通过基因工程改造的内生细菌能提高植物对甲苯的抗性，减少甲苯传播到空气中。将这种内生细菌导入植物体内，可以通过植物提高毒素的降解，减少 毒力。 如 植物内生细菌 菌株 可以通过 基因工程手段 将这类降解毒素的基因导入内生细菌，利用内生细菌为保护环境做贡献 (005)。 生细菌的促生作用 内生细菌的促生作用包括直接促生和间接促生。直接促生通过产生促植物生长物质如植物生长素（ 赤霉素（ 及细胞激动素（ 而促生。如假单孢菌属，芽孢杆菌属等都能产生吲哚乙酸或赤霉素，草生欧文氏菌不仅能产生吲 哚乙酸，而且还能产生细胞分裂素，这些物质都能有效的直接促进植物的生长。从墨西哥分离到的 18株重氮营养醋杆菌都能产生生长素，表明重氮营养醋杆菌 （ 在与植物的相互作用中不仅固氮，而且可以直接作用于植物的代谢，产生促生长物质，促进植物生长（冯永君 ,2001）。从大豆中分离的内生细菌 也 能产生 004）。吕泽勋 （ 2000） 等的研究表明，产酸克雷伯氏菌产生的生长素对水稻植株的生长和发育起着重要的调节作用。同时内生 细 菌也能通过与病原菌竞争 营养和空间或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，起到间接促生作用。如分 离 自橡树的内生细菌，有些能够产生抗生素或产生几丁质酶抑制病原菌，而分离自土豆的某些内生细菌能够产生抑菌物质抑制一种引起马铃薯环腐病的病原菌而间接促进植物生长（杨海莲 ,1999）。内生细菌也能通过帮助植物吸收 N、 从而间接促进植物生长（ 004）。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 物固氮作用 随着对内生细菌研究的不断深入 ， 研究者感兴趣的是非豆科植物内生细菌的固氮作用 。 根瘤菌在豆科植物体内的联合固氮作用是众所周知的 ， 但非豆科植物存在有固 氮菌 ， 却是 1975年 之后， 才引起了世人关注。 在巴西和菲律宾，虽然连年不施氮肥，但甘蔗和水稻依然能获得较高的产量，研究者认为就是由于甘蔗和水稻体内的生物固氮细菌利用植物体内的碳源进行代谢 ， 固定空气中的氮气 ， 提高植物可利用的氮源。 现已 从甘蔗、牧草、禾谷类植物以及棕榈树、块根植物 （ 004） 、甘薯 等非豆科植物中分离到多种具有固氮作用的内生细菌 ， 主要有 ： 巴西固氮螺菌 (生脂固氮螺菌 (无乳固氮螺菌 (伊拉克固氮螺菌 (织片草螺菌(红苍白草螺菌 (重氮营养醋杆菌 (、固氮弧菌 (和伯克霍尔德氏菌 (等（ 997） ；也有研究表明，有的内生细菌 产生的细菌素促进大豆结瘤（ 006）。 与几乎所 有植物体内含有内生细菌相似 ， 有可能几乎所有植物中也含有内生固氮细菌。 值得一提的是内生固氮菌的共生固氮与根瘤菌的共生固氮是不同的，前者不形成特殊结构，几乎可以在宿主植物的各种营养器官内发挥固氮作用；而后者必须在宿主植物的特定器官上形成根瘤，才能发挥固氮作用，共生体的宿主特异性要强于前者 （ 冯永君 ,2001） 。 瘤菌的应用 根瘤菌是 一类广泛分布于 土壤中 的革兰氏阴性菌，它 具有固氮功能， 能够 通过与相应豆科植物共生，引起该豆科植物根部或茎部结瘤， 将空气中的 而 为豆科植物提供氮素 营养，促进植物生长，增加植物产量。根瘤菌与豆科植物共生固氮体系是已知固氮能力最强的生物固氮体系之一，每年固