【毕业学位论文】（Word原稿）MyD88siRNA诱导猪调节性树突状细胞的实验研究-临床医学胸心外科博士论文

保密 2 年 申请同济大学医学 博 士学位论文 二一年五月 导猪调节性树突状细胞的实验研究 培养单位：医学院 一级学科：临床医学 二级学科：胸心外科 研 究 生： 指导教师： 教授 保密 2 年 A in 2008 书脊 2010 by of o. 055407030) 君 同济大学 学位论文版权使用授 权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年 月 日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日 缩语表 缩 语 表 突细胞 原递呈细胞 节性 T 细胞 C 未成熟树突细胞 植物抗宿主病 8 髓样分化因子 88 周血单个核细胞 组猪粒单集落刺激因子 重组猪白细胞介素 - 4 多糖 向角散射 向角散射 缩语表 混合淋巴细胞反应 干扰素 干扰 C 外周血单核细胞来源的 信号调节蛋白 亡结构域 原相关分子模式 式识别受体 介素 1 受体相关激酶 瘤坏死因子受体相关因子 扰素调节因子 7 摘要 摘要 目的 通过 合刺激猪外周血单核细胞，获得猪外周血单核细胞来源的采用 扰猪 髓样分化因子 88（ 因的表达，从而诱导出猪调节性 对干扰前后的细胞表型，免疫学功能及生物学活性进行检测，探讨猪调节性 诱导耐受的机制，为临床应用于移植耐受奠定基础。 材料和方法 提 取猪外周血单个核细胞（ 经 导，体外培养得到未成熟单核来源的 过化学合成法制备针对 因 对（序列 1 和序列 2），在 染试剂介导下转染 以转染无义 别给予 1的 用 测干扰前后 因的表达水平。流式细胞术 (检测 面 6， , 分子表达， 测定混合淋巴细胞培养 同种异体 T 细胞的刺激能力， 测定 泌 度。 结果 1. 联合应用 激猪外周血单核细胞，可以获得猪外周血单核细胞来源的 胞； 2. 质体介导的 染的最小最适的 度为 10 3. 与无义对照组相比，序列 1 和序列 2 干扰组 蛋白质表达水平下降 80%以上； 4. 测猪 表型为 6+； 摘要 激后 达有升高，而 列 1 和列 2 干扰后 6， 达降低； 5. 混合淋巴细胞反应中随着混合细胞中刺激细胞的比例增加， T 细胞反应性逐渐增强， 最强；转染 ，较之干扰前，刺激指数下降，T 细胞反应性下降，与 差异均具有统计学意义 ( 染后， 应分泌的 应分泌的 高，与 相比，差异具有显著性（ in PS 按照刺激细胞：反应细胞 =1： 10 的比率进行 检测上清液中 图 图 细胞因子检测结果 第 3 章 猪 表型鉴定，免疫学功能检测和体外成熟诱导 19 论 我们采用流式细胞术， 及相关细胞因子检测来研究 表型特征和免疫学功能。通过流式细胞术检测猪 面的白细胞抗原，发现猪达 低水平表达 分子，其免疫表型结果为 6+，符合猪 免疫表型特征 26, 30, 31。猪 表达 T 细胞， B 细胞以及 胞的表面标记分子。猪等动物的 以持续性检测到低表达的单核 /巨噬细胞表面标志物 达的与否也使 别于存在于猪血液中的传统 C， 32。 人类被认为是单核 /巨噬系统而非 胞的特征性标记，但是研究发现，随着 单核细胞被诱导成为 表达率有所下降。我们的结果显示猪 激成熟以后 达比较恒定，并无明显升高，但也有学者认为猪 达在成熟后降低 22。无论是 是 续性共表达是猪体外诱导培养的 大特 征。猪 人 着高度同源性33，我们用克隆号为 76单克隆抗体检测到猪 定表达 到 熟刺激后表达无明显增高 22。 （ ，即猪 类抗原。随着培养时间的延长，表达 细胞比例逐渐增高。我们发现， 从 表达来看 多个峰，说明体外诱导 在异质性。 分类上被称为猪的 是一种表达于髓系来源细胞的分子，存在于粒细胞和单核细胞分化阶段的早期，在功能上代表信号调节蛋白（ , 34。在人和鼠等其他一些动物中， 认为与 激 T 细胞的能力有一定关联，但在猪 否具有相同功能还有待进一步实验证实 35。猪表达 c 和 些分子属于 2 整合素，是细菌 使重要的细胞粘附功能 36。另外，猪 表达 者是 面表达的一种 37；后者则是一种 肌动蛋白聚合蛋白 38。 用 养出的 未成熟 C， 共刺激分子 表达，是研究 熟过程的良好模型 22, 39。我们用为成熟诱导剂对猪 体外进行成熟诱导，图 10， 11 显示，用 8 小时以后， 达无明显改变， 子表达上调，也有人报道 熟后表达下调 28。 猪 因为他们在受到 6 的表达上调。 第 3 章 猪 表型鉴定，免疫学功能检测和体外成熟诱导 20 例如， 脓杆菌 白，脂磷壁酸和肽聚糖； 配体 多聚尿苷酸（ 40, 41。 体对 最大作用是诱导其成熟，最直接的表现是有关抗原递呈的表面分子如 类分子， 6的表达上调 ， 熟后， 子表达上调，而且从细胞内转移到细胞表面， 但是 熟后刺激 T 细胞能力的增强并不仅仅取决于这些分 子表达的上调 42。 果表明， 激成熟的 未经成熟刺激处理的同时相 比，刺激 T 细胞增殖的能力更强，说明 导成熟的 导同种异体 T 细胞反应的能力更强大，我们发现当 T 细胞比例降至 1： 100时，仍然能观察到 T 细胞明显的免疫刺激作用。随着 成熟，趋化因子受体表达和吞噬抗原的能力下降，而刺激 T 细胞增殖的能力增强，这些功能上的变化表明 摄取抗原逐渐过渡到提呈抗原的阶段 41, 43。 成熟过程中，细胞表面的共刺激分子 有所升高，从而为激活 T 细胞提供必要的共刺激信号，我们的结果表明，猪 人类和小鼠等动物一样，受到成熟刺激后，也会呈现共刺激分子表达上调， 刺激能力增强等反应。 与 刺激不同的 如 诱导 应细胞因子 应细胞因子有 0。有意思的是， 猪 刺激下均能同时诱导较强的 泌，因而所诱导的T 细胞反应并不偏向于 者 应，而我们 细胞因子检测结果发现猪 成熟刺激 导后，成熟前后分泌 水平变化无显著性差异 26。然而， 成熟和细胞因子应答也会受到免疫调节的影响。体内的不同环境和所遇到的不同刺激信号病原体而接受到的不同刺激信号，会具有多样的反应性。体外实验有时仅能模拟一部分体内的实际情况。同样，我们在体外实验所观察到关于 结论，有时候可能在体内环境下不一定完全适用。 如果采用 仅以 以刺激猪 养 710天后产生猪骨髓来源的 胞（ 其免疫表型和生物学特性与 本相同 26，在受到 成熟刺激以后，共刺激分子和 子 表达上调，对同种异体 T 细胞增殖刺激能力增强，从比较动物学的观点来看，与其他相动物类似 44。有所区别的是，猪血液中的 在于，其表型为 有特征性高表达的 子和 第 3 章 猪 表型鉴定，免疫学功能检测和体外成熟诱导 21 6，如果继续在体外培养，这些细胞的 共刺激分子表达将进一步明显提高，并呈现明显的树突状形态 19。猪皮肤来源的 高表达 和共刺激分子 6，但不表达 与猪的 型不完全一致 45。 我们的结果显示用 外诱导 到的 型符合 征，与人类似，猪 受到 刺激发生成熟过程中 分子表达上调，趋化因子受体表达和吞噬能力下降，而刺激T 细胞增殖的能力增强。 第 4 章 构建和 染试验 22 第 4 章 构建和 染实验 料 胞 按照上文所述方法培养得到的猪 要实验器材 玻璃制品： 各型 刻度吸管 、烧杯、烧瓶 塑料制品： 各型号移液器、 枪头、 、 离心管、培养板、 培养皿、细胞计数板 仪器设备： 、 900HT (司 )、 普通 及倒置 显微镜 （ 水平式离心机 （ 司）、生物安全柜（ 司 ） 要实验试剂 胎牛血清 2 司 250 M） 司 重组猪粒单系集落刺激因子（ 司 重组猪白细胞介素 司 青霉素 (10万 U) 华北制药公司 链霉素 (10万 U) 华北制药公司 克隆抗体 司 逆转录酶缓冲液 司 第 4 章 构建和 染试验 23 司 司 5缓冲液 司 寡聚（ 2 司 度各为 x ) 司 法 构建 46 按照 用计算机软件设计，委托上海吉玛基因公司合成。 序列一： 5 - 3 ; 5 序列二： 5 5 无义对照： 5 5 脂质体转染 1. 将双链 5 M） 6 l 加入 无血清培养液 250 l 中 ,混合均匀； 2. 将 无血清培养液 250 3. 将稀释后的 合均匀，在常温下孵育 15分钟； 4. 6孔培养板轻轻吸去原来的培养液，更换新鲜的 .5 5. 将 孔板的培养液中，轻柔第 4 章 构建和 染试验 24 前后摇摆培养板 , 使混合均匀， 0 6. 将上述三组（干扰一组，干扰二组和无义对照组） 组设两个复 孔， 48小时后 72小时后 扰后 白表达的检测 离心收集悬浮的 06细胞，加入 1% 20 150 2 10 10 心吸取上清获得蛋白裂解液。用标准蛋白曲线法测定蛋白质的浓度。调整至相同量蛋白质，加入 3 上样缓冲液，煮沸 5分钟，经干式电转至 3% 脱脂奶粉过夜封闭。次日，加入一抗兔抗 1 1 000) , 小鼠抗 1 1 000) 常温下孵育 1 3%脱脂奶粉洗膜 3次 , 每次 1015 温下相应加入二抗，辣根过氧化物酶偶联的抗兔 1 3 000) 常温下孵育 1 h 以上 , 次 , 用化学发光 法或加入碱性磷酸底物显色 , 进行 扰后 达的检测 计数 5 106个细胞，加入 1照说明书的步骤提取总 用紫外分光光度法测定 88:1。以 3寡聚（ 2为引物， 反转录酶将 转录合成 时定量 应采用 x 900列分析仪上进行。具体的 应为：总体积 20 l，包括 x ) 10 l，引物 (10 m) l ，模板 5 l。 应分两步：初始变性 95 C 10 秒，继之为 95 C 5 秒， 60 C 30 秒共 40 个循环。用 18s 为阳性内对照。引物序列为： 5引物 3 引物 物采用罗氏应用科学提供的 件在线设计。 1、 细胞 110 7 2、 加 1 细胞用 1 第 4 章 构建和 染试验 25 3、 匀浆（要彻底，后转至 组织匀浆量 100 4、 颠倒混匀 10下，室温 55、 加氯仿 1/5体积（ 必须按总体积的 1/5） 6、 颠倒混匀 10下，室温 57、 4 ，离心 12000g， 158、 转上层水相（约 400l ）于另一 中 9、 加等体积异 丙醇（约 400l ），混匀室温 1010、 4 ，离心 12000g， 10弃上清 11、 加冰预冷的 75%乙醇（用 112、 4 离心 7500g， 5 13、 弃上清，空气干燥 5能完全干燥） 14、 溶于 0l （ 10l （可在 55水中， （ 表 图 第 5 章 干扰 诱导调节性 免疫调节作用 39 扰前后的 示 刺激细胞 :反应细胞 1:100 1:10 1:5 对照组 干扰 1 组 a 扰 2 组 b 随着混合细胞中刺激细胞的比例增加， 渐增强， 最强；转染 种反应性下降， 低。 扰前后的细胞因子检测的结果 用 检测 合淋巴细胞培养上清液中的细胞因子 分泌。 激后， 泌稍有增高，但与对照组相比，差异无显著性（ P 染后， 泌增高，与对照第 5 章 干扰 诱导调节性 免疫调节作用 40 组相比，差异具有显著 性（ P 图 图 图 按照刺激细胞：反应细胞 =1： 10的比率进行 P 图 按照刺激细胞：反应细胞 =1： 10的比率进行 扰组 P 第 5 章 干扰 诱导调节性 免疫调节作用 41 论 先天性免疫中的重要性在于 面的 于 识别，而族在 此识别过程中占据中心地位，是抗感染免疫反应中最重要的 特异性地识别病原相关分子模式 病原微生物进化中保守分子 , 如脂多糖 (肽聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等，通过诱导大量的趋化因子的分泌 , 以及上调趋化因子受体基因的表达，使免疫细胞快速而大量地向感染部位迁移；同时激活天然的免疫细胞，增强其吞噬和杀伤能力，在激活天然免疫中发挥重要作用 74, 75。另一方面， 能调节获得性免疫， 噬抗原、共刺激分子的表达、 成熟、迁移至次级淋巴组织将抗原呈递给初始T 细胞，激活初始 T 细胞等都受到 胞表面的 别的调控；而且抗原特异的 T 细胞激活并分化为效应细胞过程中需要的抗原肽 合物分子信号和共刺激分子信号也取决于 胞表面的 特定 识别。由此可见， 号传导途径是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁 76, 77。激活可以诱导很强的免疫应答反应，有利于机体 抗病原微生物感染或者组织损伤，但是过强的免疫反应也会导致许多不利影响，如产生自身免疫性疾病，内毒素休克，以及对移植物的排异反应等等。在稳态条件下，机体存在 时地终止 信号，以避免过强的免疫反应，以免对机体造成不利的影响。 型跨膜蛋白，在抗感染免疫上有重要作用。 胞内区含有体同源区（ ,一保守结构， 号传导通路上的许多蛋白质，如髓样分化因子 88（ 8, 白介素 1受体相关激酶（ 肿瘤坏死因子受体相关因子 都具有 构域。 一种胞浆可溶性蛋白，结构上包括 N 端的死亡结构域 ( D) ,中间区域及 C 端的 共 3 个功能区域，是 究表明， 赖性信号转导途径是大多数 号传导中的共同通路，其信号转导的过程为 : 当 受体发生二聚化 , 构象改变，此时胞质中 构域与 C 端相互作用 , 端的 集下游同样含死亡结构域的 致 身磷酸化 , 磷酸化的 离 合， 最终导致第 5 章 干扰 诱导调节性 免疫调节作用 42 和 激活，从而导致共刺激分子表达上调，并促使炎症因子的分泌 78；另 外， ( 诱导型干扰素的分泌。因此， 号向下游传导的重要的衔接分子 7, 78, 79。除了 外，所有的 可以通过 径进行信号传导，此信号通路称为 信号通路是 依赖信号通路，通过另外的接头蛋白 80。而 能通过 赖信号通路和 依赖信号通路这两条途径进行信号传导 81。 巨噬细胞等抗原提呈细胞表面是表达 类最多的细胞，这些有识别 功能，例如 别革兰氏阴性菌的脂多糖（ ， 别细菌 的 列。 分布尤为复杂，这也从侧面反映了不同 群的相应功能。 活 T 细胞需要两种信号：第一种是抗原肽 子复合物提供的抗原特异信号，第二种信号是 6 等共刺激分子提供的共刺激信号。已知第一种信号的提供与 密切关系；在抗感染免疫中，第二种信号主要也是由 供， 使 达共刺激分子 82。例如 经 进静止 达 I、 膜分子，从而使 有这些处理和提呈抗原所必须的表面结构分子 , 促使 体刺激导致炎症趋化因子受体如 调 , 而归巢受体如 调，这样有利于 迁移， 迁移过程中逐渐成熟，而 成熟对于其作为 刺激幼稚 T 细胞至关重要 83。可见， 号传导途径在调节成熟过程中发挥着重要的作用 84。 为 号传导通路中的一个关键接头蛋白，其功能缺陷不仅会导致许多 功能受损 7, 8，而且会令 成熟刺激不能产生相应的细胞因子。 使小鼠 导 对于 除小鼠 诱导了 应，这表明 子是调节 应和 应一个关键性的分子。一旦敲除了 子后，不能使该小鼠 导任何偏向于 反应，这证明了 于 作用需要通过 能起作用。 发现 陷将导致疫反 应缺陷 85，因为 除之 激下难以分泌 5 章 干扰 诱导调节性 免疫调节作用 43 而 诱导 应所需的细胞因子 86, 87。 用体内和体外实验都证实了在 敲除的情况下， 过 号传导通路诱导了 疫反应， 进一步实验表明， 刺激 大量分泌 C 分泌，是诱导 应的强刺激剂），但是 敲除后小鼠 刺激下却不能分泌 而 果补充外源性显著增强该 泌 是无法逆转 泌的高水平。这说明，尽管 是在抑制 C 所诱导的 应不单纯是由促 胞因子分泌下降所导致的，此外可能还有别的机制 88。 根据 因序列的特点，我们设计 了针对 4 对 过预实验筛选比较后我们选取了其中的两对，即干扰一序列和干扰二序列。采用脂质体导入了针对 ，我们获得了具有调节性 型的细胞，通过 而用 检测 养上清液中的细胞因子（ 分泌，从而了解 扰后 免疫调节作用。从 看，显增强了 同种异体 T 细胞的免疫刺激作用，而干扰后的 激 T 细胞增殖能力下降，说明 显减弱了 这种刺激作用。而且，干扰后 泌上升，表明干扰后的导了 T 细胞由 应的偏移 89。与人和小鼠的 所不同88，我们的结果表明 能促进正常表达 猪 导 应，说明对于猪 说，依赖 信号传导通路相对于 依赖的信号传导通路并不更占据主导地位。但而当 子被干扰以后， 导了 应，说明依赖 子的信号传导通路与非 子依赖的信号传导通路这两条通路之间存在一个很重要的动态平衡，抑制其中的一个通路的信号传导， 另外一个通路就会占据主导地位。 在正常生理情况下，成熟 幼稚 T 细胞共同作用形成所谓的“免疫突触”，并导致相应的细胞因子分泌 90, 91。已经有实验证明通过阻断 刺激分子 细胞刺激作用降低与细胞因子 92, 93。我们的结果说明，通过 术干扰猪 因，阻断了号传导途径，抑制了 胞的成熟，其与同种异体反应性 T 细胞共同作用后的细胞因 子分泌被显著改变。然而， 成熟和细胞因子应答也会受到免疫调节的影响。 族对于因在体内的不同环境和所遇到的不同病原体第 5 章 干扰 诱导调节性 免疫调节作用 44 而接受到的不同刺激信号，会具有多样的反应性。体外实验有时仅能模拟一部分体内的实际情况。同样，我们在体外实验所观察到关于 结论，有时候可能在体内环境下不一定完全适用。 胞激活后究竟是向 应细胞抑或 应细胞方向分化在很大程度上取决于 及细胞所处的微环境，而不是 T 细胞本身的状态 94。 C 采用何种方式诱导 T 细胞的免疫反应，例如大肠杆菌的 激 导 应；一种来自蠕虫虫卵的抗原能使 应 95, 96。此外， 成熟状态对于诱导免疫反应方