【毕业学位论文】（Word原稿）PFC优化通气策略与microRNA对急性肺损伤的影响及其机制研究-医学内科学博士论文

博士学位论文 化通气策略与 急性肺损伤的影响及其机制研究 姓 名：郭忠良 学 号： 0710110023 所在院系：医学院 学科门类：医学 学科专业：内科学 指导教师：梁永杰 副指导教师：任 涛 二一年五月 A in of 0710110023 2010 FC 郭忠良 同济大学 学位论文版权使用授权书 本人完全了 解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年 月 日 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 年 月 日摘要 I 摘 要 急性肺损伤（ （ 临床常见危重 症 。虽然随着机械通气策略的改进和支持治疗的进展， 死亡率有所下降，但 仍高达 35 40 。 一连续的病理过程，其中 早期表 现 。目前普遍认为 一种失控的炎症反应，但 切的 发病机制尚不十分清楚，而多数拮抗或中和炎症介质的药物，包括细胞因子选择性抑制剂 ， 疗效并不理想。 由于细胞因子数量及其种类繁多，相互作用复杂， 形成了一个级联的网络系统，仅能针 对几种细胞因子或介质的治疗难以阻止 。那么，是否还有其他途径来改善或调控 过度表达的炎症呢？ 全氟化碳 （ 一类含 8 个碳、简单氟化的烃化物，具有极高的气溶性，是气体交换理想的介质。同时， 具有局部抗炎及肺表明活性物质替换作用。但以 介质的部分液体通气（ 床应用效果并不理想，可能的原因 与通气策略选择不当 有关 。但优化通气策略是否可以改善 后尚有待于进一步证实。 新近证明的 一类 高度 保守的、内源性非蛋白编码 、长度约为 20 25小分子 单链 主要通过转录后水平调节基因的表达，估计 调控 着 30 的 动物 基因。 近几年，内毒素介导炎症反应 达谱变化国外已有少量报道，但 炎症失控的 的变化情况国内外均未见报道。以 靶基因的研究目前主要集中在肿瘤领域，那么通过 拟或拮抗进行 向干扰是否对 有效，尚有待于进一步探讨。 研究目的 1. 探讨 2. 探讨 选 出 具有免疫细胞调控功能的 探讨其对巨噬细胞炎症介质和可能靶基因的调控作用。 3. 通过建立 慢病毒表达载体，探讨 从而 为 同济大学博士学位论文 研究方法 第 一 部分 24只健康幼猪麻醉后给予机械通气，设置参数为 0 氧浓度 毒素 随机分为 4组（ n=6/组）： 1）单纯机械通气组（ 2）部分液体通气组（ 气管内给予全氟化碳 10 ml3）气管内吹气组，在机械通气时气管内持续吹气（ 2 l 4）联合组（ 记录 心肺功能和气体交换参数，测定血清 第 二 部分 96只 4鼠，随机分成 2组， 分别 为 n=80） 和 n=16）。腹腔 内 注射 10mg/同体积 随机取 同时间点（ 2h、 6h、 12h、 184h）和小鼠 24h)各 6只，眼球 采 血 后处死小鼠。测定 肺干湿比 ， 观察肺组织巨噬细胞的 浸润 情况 ，检测血清中 量，芯片技术测定肺组织 余鼠行生存率观察。 第 三 部分 培养 重悬 后 加入 100ng/养。流式细胞 技术 检测 芯片技术测定 ，将 2积比 1:50混合，继续培养 12察细胞形态 并进行 第 四 部分 从基因组中 用 和 双酶切，连接入慢病毒表达载体。 54只 4鼠，随机分为 照组 和 静脉注射 200l含 1 108/ 1 108/ 24 注射 10mg/或同体积 同第二部分方法观察小鼠肺组织炎症反应、血清细胞因子含量变化 及存活时间。 结果 第 一 部分 除 外所有治疗组 气效率指数（ 呼气潮气量（ 改善。 关治疗组同时改善心率、呼吸频率、脉搏轮廓心输出量（ 体循环血管阻力（ 动态肺顺应性（ 平均气道阻力（ 平均气道阻压（ 联合组较单独治疗组有更高的 织学检查提示各治疗组肺损伤程度有所减轻，其中联合治疗组改善更加显著。 联合治疗组各细胞因子下降幅度高于单纯 疗组，但摘要 比较统计学差异不显著。 第 二 部分 射 24h 后，小鼠的毛发紊乱、活动能力明显下降， 72h 内有 25 的小鼠相继死亡。 小鼠肺组织外观充血严重，湿 /干比明显增加 ，组织学检查 显示 肺组织明显 炎症 细胞浸润 和肺水肿 。 血清 量增加， 其中 显著 。 免疫荧光检测发现，肺组织巨噬细胞数量明显增加。 不同时段 肺组织中 达谱 与 理组小鼠 显著不同 ， 共有 76 个 现 上调和 35 个 现 下调， 其中 具 时间依赖性，在 12h 开始 各时间点 均超过 4 倍 上调 。 多数上调和下调的 短暂性改变，不同时间上调和下调 达谱有显著差异。 用 验证 熟体在 理小鼠肺组织中的表达，结果与前面 片检测的结果一致。 第 三 部分 胞在 激后细胞形态明显增大，细胞核增多，增殖能力明显增强；细胞 分子 协同刺激分子 表达明显增加。 片测定发现，共有 18 个 现 上调， 19 个 下调。虽然表达结果与我们前期体内试验肺组织 达谱有显著差异，但 表达 与肺组织某些时段的结果相吻合。 异探针法验证 熟体的变化，结果与芯片相 符。染 细胞的生长明显增强，形态增大，同时 子表达增加，而 达明显降低； 相反， 分细胞发生脱落，同时 分子和子表达下降， 达显著增加。 第 四 部分 构建 义核酸序列的慢病毒表达载体 ，并通过 测序验证 。体内试验 发现，与空载体对照组 比较 ， 处理 组 激 小鼠的状态明显改善，生存率显著提高 ； 肺外观充血明 显减轻，肺湿 /干比降低 ； 肺组织炎性细胞浸润 减少；同时小鼠 血清中 量 明显降低（ p=1.5 .5 .5 .5 .5 图 义核酸体内对 型小鼠血清 作用 of SO on LI c 00ul SO or 108/24 10mg/ 4 of 论 急性肺损伤是失控的炎症反应，其炎症过程受到多种 调控。 36通过 术对雾化吸入 鼠诱发固有免疫反应时 104个 表达进行了研究，发现吸入 h 后 46 个 现快速而短暂的升高，并且与 质细胞 衍生趋化因子（ 巨噬细胞炎症蛋白（ 表达下降密切相关，提示 有调节炎症性细胞因子的作用。 37发现 导小鼠巨噬细胞 显上调而 显下调。采用腹腔内注射 可以取得相似的效果，给予 以导致 变化，而经蛋白酶体抑制剂 处理则可以阻断上述变化，提示这 2 种 少可以短暂调控 录活性。 38报道 显上调。我们的前期研究提示，在 导 型和巨噬细胞株 明显上调。I L L T N F - 0 . 00 . 51 . 01 . 52 . 02 . 5L P S + p m i R - c o n S + p m i R - 1 5 5 A S O*66 同时 拟（ 拮抗（ 以显著改变巨噬细胞的活性。 目前关于 向干扰治疗的研究主要集中在肿瘤领域，并且取得了一定的成效。在美国，部分 经进入临床试验阶段。 但在 域的研究尚为空白。 由于 情危重，病死率高，现有治疗手段尚有各种局限性 ，探索新的治疗途径很有必要。虽然目前公论 控 衡的炎症反应 ， 但 这种反应的调控情况及相关机制依然是谜，而应用 国 际上 尚未见报道。 在本研究中，我们 在前期体外实 验基础上， 通过构建 义核酸（ 列的慢病毒表达载体，将 先通过尾静脉注射入小鼠体内，观察其对 导小鼠影响。结果显示，与空载体（ 导对照组相比， 存率显著提高；同时 理组小鼠肺外观充血明显减轻，肺湿 /干比显著降低，组织学检查提示 理组小鼠肺组织中炎性细胞的浸润明显降低；用免疫荧光法检测发现 理组小鼠肺组织中巨噬细胞的浸润数 量明显降低； 检测发现，理组 鼠血清中 水平明显降低（ p 可溶解大量的 37 和一个大气压时，溶解度分别为 530 和 1600 2100 ，对 溶解力比水分别高出 20 倍和 3 倍，与氧结合力是全血的 2 3 倍； 不透射线，故临床上很容易判断其在肺内的充盈程度和分布，此外，在一定程度上起到气道造影剂的作用，有助于观察胸腔积液、气胸、肺气肿、肺不张等疾病。当然，这一特性也会使判断浸润性肺疾患的性质和判断胸腔内置管的位置变得困难； 几乎不被人体吸收，极少通过肺泡进入循环系统，血中含量 8L/， T 降低不再是线性而是下降更明显，提示流速 8L/，肺泡通气增加。 4 6L/为安全可靠。 在具体操作时，操作者应熟悉 工作原理和管路的连接方式， 道的直径应在 2右 ，过细 体阻力太大，过粗则使整个呼吸阻力增大。管路导入应通过特制的接头，密封性应好，注意无菌操作，特别是在吸痰时由于管的影响，多需将 管撤出后才能完成吸痰工作，延长了气道开放的时间，增加了感染的机会，在助手配合下能缩短吸痰时间。 体最好能经过加温和湿化。 由于 管引起的气管插管内径减小及气流阻力的作用，可产生一定水平的内源性 别是当吹气流量大时这种作用更明显，当其比较明显时应引起注意，需进行处理，如适当减少所加外源性 采取延长呼气时间等措施。 4. 临床应 用 临床上急性肺损伤患者应用 正压通气，能有效地清除 ,17。 19对符合体外膜 式氧合 （ 准的 6 例重症 者行 向气流流速 4L/ 平均下降 22 。 20研究了 14 例急性呼吸衰竭行 患者，其中 7 例短暂 (90s)脱离通气机行 比，前者使 降（ 者使 降（ .6）外 7 例比较了离机吸痰时用或不用 果表 明吸痰时予 防止动脉血氧去饱和及吸痰引起的肺容积下降，说明 以作为一种简单有效的方法防止血氧降低。 21研究了 12 例慢性呼吸衰竭行机械通气患者撤机综述三、气管内吹气在保护性通气策略中的研究进展 99 时 效果。结果表明，经口气管插管的患者撤机后用 D/每分通气量随气流流速的上升而有明显下降，经气管切开插管的患者行 效果不如前者，其原因可能为气管切开本身已减少了解剖死腔。因此，以为临床上撤机困难，需要减少死腔和呼吸功、增加肺泡通气的患者提供帮助。 单独用于部分慢性呼吸衰竭患者 ，能降低 每分通气量。2等报道 5 例 柱侧凸、肌营养不良引起的慢性 留 (平均 6 10者，予 5L/内空气行 低每分通气量18 ， 5 ， 7 ，其中 2 例行 12 个月，与通过气管切开的导管呼吸相比，氧合较好， 所改善或保持不变。另有研究表明 降低慢性呼吸系疾病患者的呼吸氧耗 23。 者中的应用效果随阻塞类型的不同而不同。肺实质相对正常的慢性支气管炎患者主要因气 道本身病变、阻塞致 留， 果较好；而肺气肿的患者因肺实质异常使 多，气道阻塞为功能性压迫，故 效果尚不明确。不对称性疾病限制肺的充气能力也适于用 肺切除术后或单侧肺损伤。 防止吸痰时动脉血氧饱和度下降，并有利于撤机的进行。 呼吸衰竭的原发病因为神经肌肉无力的患者也适于用 于这些患者呼吸所需工作量与实际能力间不成比例而造成 、 留和呼吸困难，肺实质通常保持相对正常， 比例较大，故可提高 果。 5. 存在的问题 主要作用为 减少 T 下降，如果 大，则效果较差。 4等证明伴有大量肺泡死腔的肺损伤应用 ，其减少死腔通气的作用减低。 使痰液变得粘稠，甚至气管粘膜出现溃疡，故 源的温化湿化问题尤为重要 15,23。 长时间应用 能导致分泌物的浓缩和溜留，特别是当吹入气体湿化不足时，即使是短暂的呼出道阻塞，导管也能很快吹入大量气体，迅速导致威胁生命的气压伤。故有人建议在气路中用一种压力释放装置，当气道突然阻塞时能自动停止导管内气流吹入，或通过在腔外放置导管或经包埋 在气管插管壁中的通道吹入气体等方法以解决腔内导管影响呼气流量和气道分泌物的清除 25。 不能用阻断呼吸通路的方法测量呼吸参数，因其易致肺损伤且由于导管气流影响，结果不准确。 在应用某些通气方式（如压力控制通气）加用 100 时，气道峰压常常会超过预置压力水平而增加气压伤的危险，并对血流动力学产生不良影响 21。 导管内高流速的气流增加支气管表面的局部压力，足以引起粘膜损伤 25。 6. 展望 为一种新的辅助通气技术，具有很好的应用前景。特别是对肺顺应性下降、氧合恶化的 者， 以明显降低预设潮气量和相同 件下气道支持压力，从而有效减少气压伤的发生，并且有利于氧合能力的改善。当然， 术有待于进一步完善，其中主要是其安全性问题，诸如当有气道机械阻塞时如何防止肺过度充气和避免肺内压骤然升高， 体的湿化问题及长期应用 对气管粘膜的损伤问题等。今后应重点解决气道湿化不良、防止气道内压骤升、 路减少气管插管内径等问题。开展随机、前瞻、对照性临床研究，明确 术能否显著降低急性肺损伤患者 生率和病死率。另外长期应用 安全性尚需 进一步探讨。 参考文献 1. . as an to 2002, 8(2): 1712. 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