【毕业学位论文】（Word原稿）结球甘蓝遗传图谱的构建及主要农艺性状的QTL定位蔬菜学硕士论文

密级 ： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 结球甘蓝遗传图谱 的构建及 主要农艺性状的位 of a ap of a ap 摘 要 结球 甘蓝 简称甘蓝 (起源于地中海至北海沿岸 ，是 国内外 普遍种植的一种重要蔬菜。 构建一张高密度的永久分子遗传图谱 不仅是分子标记辅助 育种 、 确定位的基础，也是基因图位克隆的关键 ，具有重要的理论意义和实际应用价值 。本研究利用 不同生态型的结球甘蓝栽培品种的高代纯 合 自交系 624 和 24交获得 ，再通过游离小孢子培养获得 102 个 系 （ ，以此 群体为 试材 ，利用 子标记构建甘蓝分子遗传图谱 并进行主要农艺性状的 位。 主 要研究结果如下： (1) 对 甘蓝 6 种基因型的 进行游离小孢子培养，结果有 3 种基因型的出胚率较高 ，其余的 3 种基因型 却很难获得小孢子胚， 说明胚状体的发生存在基因型间的差异。 最终 从 624 和 241 代中，通过 游离 小孢子培养 构建了 包含 102 个 株系 的 群体 2) 利用双亲对 物进行筛选，从 512 对 物组合中筛选出多态性较好的引物组合 87 对， 用这 87 对引物组合对 群体进行分子检测， 产生多态性标记 771 个，平均 引物组合 ， 其中来源于亲本 624 的标记有 408 个，占总标记数的 来源于亲本 24标记有 363 个，占总标记数的 符合 1:1 的分离比。 另外 ， 记也 出现 了 高比例的偏分离，偏分离标记有 459 个， 占 记总数的 偏分离的标记中偏向 亲本 624 的标记为165 个，偏向 亲本 24标记为 294 个，各占总偏分离标记数的 表明该 体 的偏分离 偏向于父本 24基因型。 (3) 运用 件对 771 个 多态性 标记进行分析， 获 得了一张由 8 个连锁群组成，包括 458 个标记，覆盖基因组 655甘蓝 子 连锁图谱，平均 图距为 锁群长度在 30151间，连锁群标记数为 5 个 165 个，平均图距为 6锁群中包含 263 个偏分离标记，所占比例为 统计偏分离标记在连锁群中的分布，发现 大部分或将近一半标记都为偏分离的标记，表明这些染色体区段有可能存在偏分离热点区域。 该图谱是 目前第一张利用结球甘蓝品种间杂交获得的 体构建的分子遗传图谱。 (4) 应用软件 多 型 法 对甘蓝 25 个主要 农艺性状进行 位和遗传效应分析 ， 共 检测到了 11 个 与 主要农艺 性状 相关 的 布于 6 个连锁群上。 其中控制开展度 、最大外叶长、外叶形状、株型、最大外叶柄长和外叶叶脉这 6 个 与 叶片相关 的 性状 的 1 个，其贡献率 分别 为 控制叶球形状 、叶球质地、外短缩茎长、叶球内颜色和叶球高这 5 个 与 叶球相关 的 性状 的 1 个，其贡献率 分别 为 关键词： 结球甘蓝 ， 体 ， 记 ， 遗传图谱 ， 农艺性状 ， 位 in ea ea is an in a is TL A 02 by 1 24 4-5 of In 2n=18) TL as (1) of of in It on a of a DH by 1 24 4(2) 87 as 12 Cs H 71 .9 C. 71 408 ( 24 63 ( 471 :1 In a of 59 71, 65 ( 24 94 ( 4H to 4(3) .0 71 A 58 55 cM an cM of in 0cM 51 of in 65,is cM A in G7 in in or a of is H of in .0 TL in 7 in 11 1 6 of 5 of of of DH 录 第一章 引言 . 1 传连锁图谱的构建 . 1 图群体的建立 . 2 于构建图谱的分子标记 . 3 位 . 5 物数量性状遗传 . 6 位方法 . 6 薹属作物遗传图谱的构建及重要农艺性状相关的 究进展 . 8 薹属作物遗传图谱的构建 . 8 传连锁图在芸薹属作物中的主要应用 . 10 薹属重要农艺性状的 位 . 11 蓝类遗传图谱构建中需要进一步解决的问题 . 12 研究的目的与意义 . 13 第二章 材料和方法 . 14 图群体的构建 . 14 验材料 . 14 离小孢子的培养 . 14 孢子苗的继代和染色体加倍 . 14 子图谱的构建 . 15 因组 取与检测 . 15 析 . 15 物组合筛选与 分离群体的分子检测 . 19 据记录 . 19 锁图构建 . 19 析 . 19 H 群体田间性状调查 . 19 据整理和 析 . 22 第 三章 结果与分析 . 23 H 群体的构建 . 23 状体的发生和成苗 . 23 尖镜检和秋水仙素加倍 . 24 蓝 离群体的构建 . 24 子图谱的构建 . 25 子标记的多态性的筛选 . 25 V 析 . 34 片相关性状的 析 . 34 球相关性状的 析 . 37 第四章 讨论和结论 . 48 同因素对图谱构建的影响 . 48 本的选配 . 48 H 群体的构建 . 48 H 群体的大小 . 48 记的选用 . 49 建的分子遗传图谱的问题 . 50 子遗传图谱大小比较 . 50 记的偏分离及产生的机制 . 51 其他遗传图谱整合的可能性 . 52 析 . 52 图及其影响因素分析 . 52 子标记 助育种展望 . 54 论 . 55 . 55 . 55 . 55 . 55 参考文献 . 56 附录 . 62 致谢 . 64 作者简历 . 65 文 缩 略 表 英文缩写 英文全称 中文名称 增片段长度多态性 量性状位点 双单倍体 展度 of 叶叶尖形状 叶数 高 型 叶形状 叶蜡粉 叶叶脉 he 大外叶宽 he 大外叶长 大外叶柄长 球质量 球高 球宽 球外露性 of 球形状 球颜色 of 球内颜色 球质地 球裂球 叶球熟性 叶球紧实度 心柱长 心柱宽 短缩茎长 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 甘蓝 (为 十字花科 (芸 薹 属 (甘蓝种（ ，起源于地中海至北海沿岸，由不结球野生甘蓝演化而来。甘蓝的适应性及抗逆性强 , 容易栽培 ， 营养价值高，是世界各地广泛种植的一种重要蔬菜，在我国各地也普遍栽培，分布地区广 , 栽培面积大 , 具有重要的经济价值和食用价值 ， 因此开展对其遗传学和分子生物学的研究十分必要。 许多 作物的 重要农艺性状为数量性状，它们既受基因 型 的控制，又受环境 条件 等因素的影响。传统的数量性状遗传分 析不能有效地检验出某单个遗传位点、染色体上的位置及与其 他 基因的连锁关系，高密度饱和分子标记连锁图的建立就使其成为可能。 体是对单倍体植株经过自然或人工加倍就可以得到基因位点纯合的加倍单倍体系， 体因其基因型纯合，群体间存在着遗传多样性，且无遗传变异，既可以进行连 续多年的积累性研究，也可供不同实验室开展平行性研究，用同一群体 的 数据还可累加。因此，被认为是数量性状基因位点分析的良好群体（高用明，2000）。 20 世纪 80 年代后期发展起来的分子标记技术，以其数量丰富、遗传稳定、不受基因表达与否的限制以及操 作简便等独特的优越性，被广泛应用于植物学研究的各个领域，其中遗传图谱的构建是遗传学研究的重要内容 , 一张高密度遗传图谱的构建，不仅可用于标记辅助选择、数量性状 基因 定位，还可为图位克隆、基因组结构和功能研究等打下坚实的基础（卢钢等， 1999）。 近二十年来，由于各种新型分子标记技术的发展和应用，植物高密度遗传图谱的构建工作取得了很大的进展。利用日趋饱和的遗传图谱为工具和日益完善的 位分析方法，已在多种作物上定位了许多控制不同性状的 分析了各 效应。这不仅大大加深了对数量性状遗传基础的认识，而且也极大地增强了对数量性状的遗传操纵能力。 传连锁图谱的构建 遗传连锁图谱 （ 是指以染色体重组交换为基础，采用遗传学方法将基因或其 他 序标定在染色体上构建的连锁图，以染色体重组交换率为相对长度单位，单位用厘摩（ 示（杨金水， 2002）。 分子标记遗传连锁图表示各标记所对应 段在染色体上的相对位置 ， 是分子标记运用于作物遗传育种的基础 ， 是进行基因定位 、 基因克隆 、 辅助选择育种的基础 ， 在遗传 学理论 、 功能基因组学以及遗传育种等领域已显示出了十分重要的作用（ 沈法富等， 1997）。 构建遗传图谱 包括以下几个基本步骤 ： 选择适合作图的 记； 根据遗传材料之间的 态性，选择用于建立作图群体的亲本组合； 建立具有大量 记处于分离状态的作图群体； 测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型； 将所得的条带进行计算机处理构建出标记连锁图。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 图群体的建立 本选配 亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般应从以下四个方面对亲本进 行选择，第一，选择 态性丰富的材料作为亲本。一般而言，异花授粉植物的多态性高，自花授粉植物的多态性低。例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的作图群体；番茄的多态性差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体。一个图谱上标记连锁得越多，则其利用价值就越大。因此，应尽量选择具有大量差异的可遗传性状的品种作为作图亲本。第二，尽量选用纯度高的材料作为亲本。第三，还要考虑杂交后代的可育性。亲本间差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间重组率偏低， 及 严重的偏分离现象， 从而 降低所建图谱的可信度和适用范围，严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。第四，选配亲本时还应对亲本及其 双亲间存在相互异位，或多倍体材料（如小麦）存在单体或部分染色体缺失等问题，那么其后代就不宜用来构建连锁图谱。 图群体 到目前为止很多 作物 的遗传图谱已被建成，并且许多 作物 已按不同的作图群体构建出了多张遗传图谱。根据分离群体的特点可分为三大类：临时性分离群体 (交 (C)群体等 )，它的显著特征是群体中的每 一个个体其后代均可发生分离。永久性分离群体 (由基因型不同的同质品系组成 )，包括重组自交系群体 (双单倍体群体(H)。它的显著特征是群体不会因种植世代的增加而发生改变，重复性好，它们研究的信息可以收集到同一个数据库中以实现信息共享，为更多的研究者所利用。近等基因系群体 (它的基本特征是整个染色体组的绝大部分区域完全相同，只在少数几个甚至一个区段彼此存在差异。因此，它能 使基因组中只存在一个或几个 除其他背景干扰和消去主效 不同类型的 作图 群体各有其优缺点 （表 ， 1代，再由其自交所得到的群体，构建起来比较省时 ， 但由于每个 只能使用一代，限制了该群体的作图能力。 1代与一亲本回交产生的群体， 1代配子的分离比例，因而其作图效率最高，但其缺点也是不能长期保存。 2个体连续自交多代，以至于后代基因组相对纯合的群体，因此 且作图的精确度也较高。但对于异花授粉植物由于存在自交衰退现象，建立 1进行花药培养或游离小孢子培养得到单倍体后代，再经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体，可 作为永久性群体，该群体可在不同环境中生长，便于重复试验，长期使用，既能提高 能揭示 晓武等， 2005； et 1982）。 但 在少数几个甚至一个区段彼 此存在差异。因此，它能使基因组中只存在一个或几个 离，消除其 他 背景干扰和去除主效 近发表的大量图谱中多数是利用 建 。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 表 不同作图群体的特性 of 征 H 体的形成 后代 准确度 低 低 高 高 高 最高 需群体大小 大 大 小 小 小 小 永久性群体 否 否 否 是 是 是 分离比率 1:2:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 构建费用 低 低 高 中等 中等 高 构建时间 短 短 长 短 长 长 体大小 遗传图谱的精度和分辨率在很大程度上取决于作图群体的大小。群体越大，作图精度越高 ，但群体太大，不仅增加实验时间还增加费用 ， 因此应当权衡确定合适的群体大小。从作图效 率看，作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面：一是从随机分离结果可以辨别的最大图距，二是两个标记间可以检测到重组的最小图距。如果是构建分子标记骨架连锁图，可采用大群体中的一个随机小群体 (如 150个单株或 株系 )，当需要精细地研究某个连锁区域时，可针对性地在骨架连锁图的基础上扩大群体。这种大小群体相结合的方法，既可达到研究的目的，又可减轻工作量。另外，作图群体大小还可取决于所用群体的类型。由于 用较大的群体以保证每种基因型都可能出现。 1代 配子中基因的分离和重组，因此从作图效率来看， 需太大的作图群体。 在相 同 的作图精度下，所需的群体大小的顺序为 谭远德等， 2000）。 于构建图谱的分子标记 子标记技术的诞生和发展极大地促进了遗传图谱的发展。分子标记种类繁多，按其标记原理主要可分为两类（ 1996），一类是传统的 以 交为基础的分子标记，如；另一类是基于 术发展起来的分子标记，按照 需引物类型又可分为：（ 1）单引物 记，其多态性来源于单个引物长度或序列的变异，包括有 技术；（ 2）双引物选择性扩增的 记，通过引物 3端碱基的变化获得多态性，主要指 记；（ 3）需要克隆、测序来构建特殊双引物的 记，如 记、小卫星 卫星 。常用于构建图谱的几种分子标记介绍如下 ： 限制性片段长度多态性 ） ，为第一代分子标记技术。其原理是基因组 经特定的内切酶酶切消化 后，产生大小不同的 段，通过 迹和特定序列的探针杂交后，显示出 子水平上的差异。基因组序列的改变引起内切酶位点 的 缺失或插入，从而造成酶切后 段打消的多态性。与传统遗传标记相比， 记具有数量丰富， 具 有 共显性，且不受环境、组织特异性等因素干扰 的优点 ，因此，特别适合构建遗传连锁图谱。由于 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 记 具有的这些优点， 记 曾被广泛应用于植物遗传图谱的构建。尽管 术已在较为广泛的研究领域得到应用，并取得了许多令人瞩目的研究成果，但 态性检测的灵敏度不高， 锁图谱上还有许多的空间区。同时， 存在着操作复杂、成本高、费时费力等问题，特别是检测中要使用放射性同位素，所有这些在很大程度上 限制 其推广和应用。 987 年，美国 司的 人推出了一种全新的生物技术 发明者因此而荣获 1993 年度诺贝尔化学奖。 分子标记技术的发展起了巨大的推动作用，迄今已有的分子标记技术除了 ，其余的都与 关，正是在 础上， 1990）利用位点序列的核苷酸 片段（通常为 10 个碱基，也称随机引物（ 未知序列的基因组 行扩增，获得了不连续的 段，称之为 用一系列引物， 以对整个基因组 行多态性检测。因此， 可用于图谱构建工作。与 比，有以下优点：（ 1）技术简单，检测速度快；（ 2） 析只需少量 品；（ 3）不倚赖种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；（ 4）成本较低。但 1） 记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和 纯合子；（ 2）存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开那些长度相同但碱基序列组成不同的 段；（ 3） 术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。 术具有的优点显而易见，因此 术一经发明就被迅速用于种质资源、植物分类、基因定位、遗传作图等方面。 为第一代分子标记已被广泛地应用于植物的遗传作图，而 为第二代分子标记，又为分子连锁图谱提供了新的标记来源。与 似的还有 用的引物较长，一般为 10 50 使用的引物长度比 至可短至 5这 3 种类似的标记中， 用最为广泛。 1993 年由荷兰科学家 展起来的一种检测 态性的新方法，是纹技术的重大突破，也是目前国际上 较