【毕业学位论文】（Word原稿）蜂花粉中黄酮类化合物的检测及纯化方法的研究特种经济动物饲养硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 蜂花粉中黄酮类化合物的检测 及纯化方法的研究 on s on I 摘 要 黄酮类成分因其具有多样生物活性成为目前天然产物研究的热点。但有关蜂花粉黄酮分离纯化与检测方面的研究国内外未见报道，本研究在这些方面作了初步探索，首次建立了一套经济、安全的蜂花粉黄酮纯化与检测方法。 本研究通过三种检测方法的比较，确定了聚酰胺 检测波长为 360芦丁为标准品，在 围内，其浓度与吸光度呈良好的线性关系，相关系数 均回收率分别为 稳定性、精密度和重现性均理想，其 别为 n=3), n=3)、 n=5)。该法检测油菜蜂花粉中总黄酮含量为 本研究采用聚酰胺对蜂花粉黄酮进行分离纯化。通过静态吸附与解吸实验考察了聚酰胺对蜂花粉黄酮的吸附和解吸情况；通过动态吸附与解吸实验确定了蜂花粉黄酮分离纯化的操作条件。结果证明聚酰胺动态吸附量达 g 干树脂以上，洗脱率可达 96%以上，分离纯化后的产品蜂花粉总黄酮含量约达 20%，较原材料中蜂花粉黄酮含量提高 13 倍。 关键词 ：蜂花粉，总黄酮，纯化，检测 is in of to Up to is of on or of an a of of a of of 60a of of n=3). to to to in of an to of in g 6%. of of 0%, 3 of 录 第一章 绪论 1 1 . 1 研究目的和意义 1 1 . 2 国内外研究现状 4 聚酰胺层析法的研究 4 花粉黄酮类化合物的研究 5 研究内容和方法 11 预期目的 12 第二章 蜂花粉 总黄酮检测方法的研究 13 蜂花粉总黄酮的三种不同检测方法 14 酰胺 14 比色法 15 双波长比色法 15 蜂花粉总黄酮不同检测方法的比较 16 品 前处理对检测结果的影响 16 定性的比较 16 标回收率的比较 17 密度的比较 17 聚酰胺 重现性试验 17 结果与讨论 18 第三章 蜂 花粉 总 黄酮 分离 纯化方法的研究 25 材料与方法 25 实验部分 29 静态吸附及 解吸 实验 29 动 态吸附及 解吸 实验 30 产品鉴定 31 结果与讨论 32 第四章 结论与展望 40 参考文献 42 致谢 47 作者简历 48 V 插图清单 图 1黄酮 ) 6 图 2酰胺法芦丁标准品吸光度 18 图 2色法芦丁标准品吸光度 19 图 2波长法芦丁标准品吸光度 20 图 2同前处理对检测结果的影响 20 图 3丁标准品吸光度 28 图 3温下聚酰胺对黄酮类化合物的静态吸附动力学曲线 32 图 3温下黄酮类化合物质量浓度对聚酰胺树脂吸附性能的影响 33 图 3温下黄酮类化合物质量浓度对聚酰胺树脂吸 解 附性能的影响 33 图 3样量对聚酰胺吸附率的影响结果 34 图 3液浓度对聚酰胺吸附的影响结果 35 图 3液酸碱度对聚酰胺吸附的影响结果 35 图 3同体积分数的乙醇与吸附量和解吸率的关系 37 图 3同酸碱度的乙醇与解吸率的关系 37 图 3脱剂的用量对洗脱效果的影响 38 表清单 表 2酰胺 标准品溶液浓度与吸光度的关系 18 表 2色法标准品溶液浓度与吸光度的关系 19 表 2波长法标准品溶液浓度与吸光度的关系 19 表 2酰胺法稳定性实验结果 21 表 2色法稳定性实验结果 22 表 2酰胺法测定的加样回收率结果 22 表 2色法测定的加样回收率结果 22 表 2酰胺法的精密度 23 表 2色法的精密度 23 表 2现性实验结果 23 表 3准品溶液浓度与吸光度的关系 28 表 3态吸附实验吸收度变化 32 表 3酰胺树脂富集后总黄酮的纯度与得率的关系 39 中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪 论 究的目的和意义 花粉是植物的雄性细胞，是植物的“精子”。蜜蜂采集回巢的花粉，称为蜂花粉。蜂花粉中除含有一般花粉的成分外，还含有蜜蜂在采集时加进去的少量花蜜和分泌物，因此蜂花粉与一般花粉的成分略有差异。其外表也不同于粉末状的花粉粒，而是经蜜蜂加工过的多为扁圆形的、上面带有蜜蜂后肢嵌挟痕迹的花粉团，富含包括黄酮类物质在内的多种营养成分，是当今世界最具有使用价值的天然产物之一 ，在营养、保健、化妆品、医疗等领域得到广泛的应用。 我国早在神农本草经中就有花粉的记载和应用，并将“蒲黄”列为上品，“无毒，久服轻身，益气力延年”。在木草纲目中记载松花即松花粉，“酒服令轻身，令人收黄 (松花粉 )和白沙糖印为饼膏，充果饼食之”，具有“润心肺，益气，除风止血”之功效，在古今秘苑中，记有李商隐的诗句“借问健身何物好，无心摇落玉花黄”，玉花黄即是玉米的花粉，可见我国用花粉保健治疗之早。世界许多国家的人们均在食用花粉，并赞美花粉是永葆青春和健康的源泉。苏联科学家调查苏联百岁 以上的老人发现，有 150位老人是以养蜂为业，常食蜂蜜沉渣，这些沉渣几乎是纯花粉，使之长寿。 近年来，蜂花粉的开发利用研究在国内外已广泛地开展，已引起人们的重视。许多国家的植物学家、营养学家和医药工作者均很关注蜂花粉的开发利用研究，各自在自己的领域内进行了大量的实验工作，取得了满意的效果和宝贵的数据，做出高度评价。在欧美一些国家中，将花粉加工制成各种制剂，食用和药用，欧洲称之为“完全营养食品；日本的花粉研究者则认为：任何植物性的食物营养价值均难与花粉抗衡，并称之为“健康美容之源”。由于花粉的神奇功效，蜂花粉的 开发利用研究风行于世界，方兴未艾。欧、美一些国家兴起花粉热，利用花粉食品，提高食品业营养价值。我国也利用花粉作食品添加剂和医药保健品，提高食品的营养价值和防病治病。 蜂花粉的成分相当全面、复杂。各种蜂花粉因植物来源不同，所含成分种类及含量也不同。不同季节生产的蜂花粉其成分及含量也有差异，但差异不大。一般蜂花粉所含营养成分大致是：蛋白质 20% 25%，碳水化合物 40% 50%，脂肪 5% 10%，矿物质 2% 30%，木质素 10% 15%，未知物质 10% 15%（王开发， 1993）。 蜂花粉中几乎含有人类迄今发现 的所有的氨基酸，而且含量高，部分以游离形式存在，能直接被人体所吸收。一个活动量较强的成年人，每日食用 20 25花粉中所含碳水化合物，主要是葡萄糖、果糖、蔗糖、半纤维素、纤维素等。这些都是人体的主要能源，是心脏、大脑等器官活动不可缺少的营养物质。蜂花粉中类脂含量较高，平均含量 其中皂化类脂含量 非皂化类脂含量 蜂花粉中所含脂类中不饱和脂肪酸占 60% 91%，远比一些动植物油脂中的含量高，例如猪油含不饱和脂肪酸为 菜籽 油为 不饱和脂肪酸是人体不可缺少的营养物质，具有降低血中胆固醇和甘油三酯，增强毛细血管通透性及促使动物精子形成等特殊作用。蜂花粉是天然的多种维生素浓缩物，含量高、种类全（宋心方， 2000）。浙江省医学院胡欣等人对我国 11 个地区 14个品种 23 个样品蜂花中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 2 粉 (100g)的抗坏血酸含量进行了分析，结果抗坏血酸含量在 围之间，平均值为 据报道，蜂花粉中还含有胆碱和肌醇，并且含量较高。据报道，每 100有肌醇 的蜂花 粉每 10000究证明，生长素是花粉重要的营养成份之一（王开发， 1997），其中人生长素是 191 个氨基酸残基组成的一条多肽链。生长素促进生长作用最显著是对骨、软骨及结缔组织的影响，对代谢作用是增加肌肉对氨基酸的摄取，促进蛋白质、 合成，并可以促进脂肪转化，增加血中游离脂肪酸量。王开发 1991 年利用激素放射免疫测定盒测定花粉中人生长素的含量，不同种类花粉的人生长素含量相差很大，高者如蚕豆花粉达 低者如苹果花粉仅有 生长素含量高者为蚕豆、蜡烛果、 紫云英等花粉，而含量低者有苹果、茶、沙梨等。花粉中还含有 6种植物生长调节激素，它们是生长素、赤霉素、细胞分裂素、油菜素内酯、乙烯和生长抑制剂，它们对生物的生长、发育起着极为重要的作用。蜂花粉中除含有钙、磷、钾、钠、镁、硫等外，还含有多种微量元素，如铁、铜、锰、钻、锌、碘、硒等 20余种，其中有人体必需的 10 余种，对人体保健和生长发育有着重要意义；此外，蜂花粉中还含有多种活性酶，现已发现各类植物花粉中己有 80 余种酶存在，其中主要的是水解酶及转化酶，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶、细胞色素、氧化酶等 。能改善细胞的氧化还原能力，激活酶的活性中心，防止细胞中酶自身的破坏，从而控制衰老及某些疾病的发生；蜂花粉中还含有丰富的有机酸，如三萜烯酸、没食子酸、原儿茶酸、以及抗前列腺增生的主要成分环氧肟酸等。 值得一提的是 蜂花粉是由蜜蜂采集的植物花粉，而植物花粉含有种类繁多的黄酮类物质，包括糖苷和糖苷配基以及 肉桂酸衍生物 等（ 1989； 1984）。 蜂花粉含有丰富的黄酮类化合物（刘起华 ， 1999）， 这类化合物具有抗动脉硬化、降低胆固醇、解痉和防辐射作用，是花粉中重要的营养成份之一，而且含量丰 富。 在蜂花粉诸多成份之中，黄酮类物质和他们的生物学活性已成为研究热点，目的是为了以此建立蜂花粉的质量参数（ J. 2001），并评估他们的营养和生物学的特征 （ 1993； 2003）。 目前从花粉中发现的黄酮类化合物有 :黄酮醇、槲皮酮、山奈酚、杨梅黄酮、木犀黄素、异鼠李素、原花青素、二氢山奈酚、柚 (苷 )配基、芹菜 (苷 )配基等（ 王开发， 1999）。 任玉翠等（ 1990）对 12 种花粉（ 100g)进行分析，得出油菜蜂花粉黄酮苷含量最高 瓜最低 同的花粉总黄酮含量差异很大，高者达 9%，低者为 其中含总黄酮丰富的花粉为：板栗、茶花、蚕豆、飞龙掌血、紫云英、芸芥、胡桃等。在复杂的生物化学反应过程中，黄酮类化合物的自身氧化而使其具有较强的抗氧化性，黄酮类化合物对于羟基自由基有较好的消除作用而能延缓人体衰老（董世林， 1994）。黄酮类化合物的生理作用具有多样性及其保健作用（丁利君， 2002），使花粉越来越受到人们的青睐。早在 20世纪 90年代，德国联邦卫生局已将花粉列为药品。 蜂花粉的治疗特性使它被广泛应用 ， 因此蜂花粉 提取物被用于慢性的前列腺炎 ， 应为其具有 抗炎和抗 雄激素作用（ 2002， 2003）。 因为芦丁（槲皮素糖甙）是花粉黄酮中最丰富的成份，所以蜂花粉可以减少毛细血管的脆性（ P. 1998）。 蜂花粉中众多生物活性物质的存在，对加强人体的代谢与物质的合成，对中枢神经系统兴奋性，对生长与发育，对维持多种生理器官功能，有着重要的调节作用和广泛的医疗效能。蜂花粉具有延缓衰老的作用，主要是作用于中枢神经系统，促使下丘脑和各种垂体增强活动能力，延长活力时间。老年人服用蜂花粉，可刺激 下丘脑的神经元，有利于本己疲劳或功能出现衰退的神经中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 3 组织得到恢复，从而减缓了衰老进度。国内外专家通过大量研究证实，蜂花粉有改善精神状态和提高精力、体力的作用。花粉对脑的作用，主要是为脑细胞的发育提供了丰富的特有营养物质，增强了中枢神经系统的功能和平衡调节，使大脑和机体保持旺盛的活力。蜂花粉具有提高免疫能力和抗癌作用，食用蜂花粉，能刺激胸腺分泌量增大，提高 就大大提高了机体的免疫能力，从而预防各种疾病特别是肿瘤的发生。花粉还能够提高人体血清免疫球蛋白 到促进巨噬细胞的 吞噬作用，增强了抵御细菌、病毒的能力，还具有中和毒素的功能。蜂花粉是前列腺疾病的克星。瑞典医生首次采用蜂花粉治疗前列腺炎，如今，日本、德国等好多国家均采用蜂花粉治疗前列腺疾病，我国流行最广的治疗前列腺病特效药“前列康”，其主要成分就是蜂花粉。蜂花粉对治疗贫血有特效，蜂花粉有利促使受创的骨髓尽快恢复功能，能加快造血组织的修复和血细胞的新生，对保证造血功能的正常运转发挥着积极的良好作用。蜂花粉对肝脏细胞有良好的保护作用。蜂花粉富含维生素 增强毛细血管强度，防治毛细血管通透性障碍、脑溢血、视网 膜出血、高血压、静脉曲张等均有良好的效果。食用蜂花粉不但能增加食欲，而且能促进消化系统对食物的消化吸收，还起到增强消化系统功能的作用。蜂花粉的有效成分可使皮肤直接吸收，它能改善皮肤营养状态，促进皮肤的新陈代谢，防止皮肤干燥脱屑，增加了皮肤的弹性，从而有利消除皱纹，延缓衰老和皱裂。除以上作用外，蜂花粉对妇女更年期综合症和月经不调有奇效，也是妊娠妇女的最佳天然营养食品，并可能有效地预防感冒，尤其对流感预防效果更佳。 在人们回归自然，追求绿色健康的生活观念的指导下，具有生物活性的天然产物逐渐受到人们的青睐与厚爱。 运用现代化的科学技术手段对天然活性成分进行分离、纯化、结构的鉴定、结构与功能关系的研究，是天然产物在新世纪研究发展的趋势，而具有生物活性的黄酮研究则是其中的一个重要的组成部分。现在方兴未艾的天然植物黄酮的研究与开发促进了蜂花粉的综合开发利用。天然植物黄酮产业正经历着由局部走向全部，其应用也从辅助型的食品添加剂向作为防治心脑血管疾病的新型药物的方向转变。与银杏黄酮相比，花粉黄酮的开发利用显然更具优势，因为银杏叶黄酮的开发利用与其创造的经济效益均已接近饱和，这为花粉黄酮的开发和应用提供了一个很好的契机。 进行蜂 花粉黄酮提取研究的三大理由： 与已经产业化的银杏黄酮、大豆异黄酮相比，油菜蜂花粉中的黄酮含量更高， 我国蜂花粉年产量约 3000 吨 , 蜂花粉是可再生资源，采集蜂花粉不会对生态环境造成破坏。因此对花粉中的黄酮类物质进行提取分离和应用研究将具有较高的经济价值。 蜂花粉黄酮提取物的产业应用价值体现在以下几个方面：首先，花粉黄酮是一种优良的保健食品功能因子，其作为医药中间体极具市场潜力；此外，花粉黄酮还可作为天然食品抗氧化剂、天然植物饲料添加剂、生物杀虫剂等，并可广泛应用于化妆品行业。 我国年产蜂花粉超过 3000 吨 ，大部分以原料花粉粗加工的方式进入市场，产品附加值低，市场占有率低。进行蜂花粉的深加工，对其功效成分进行分离、提取和富集，以提高其产品附加值是当今的趋势，也是 蜂花粉产业化发展的必由之路，通过蜂花粉深加工产品的不断面世，可刺激市场需求，扩大市场份额，带动蜂花粉产业的发展，以促进养蜂业的持续发展，从而使数以万计的人从蜂花粉等蜂产品中获取利润，改善生活水平。我国具有丰富的蜜粉源植物资源，很多蜜粉源植物分布在老、少、边、穷地区，在当地开发蜂产业可以直接起到脱贫致富的作用。此外，中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 4 蜜粉源植物可持续利用，无需特别投入，在 涵养水土、保护生态环境中发挥着特殊的作用，因此，蜂花粉黄酮的开发和利用具有极为重要的经济和社会意义。 内外研究现状 蜂花粉中的黄酮类物质 是植物生长过程中形成的一类次生代谢产物，是花粉中重要的生理活性物质，包括十几种糖苷及配糖体， 具有良好的保健、药用功效，但是蜂花粉黄酮的研究还处于相当滞后的状态，对于花粉黄酮的检测有为数不多的报道，但蜂花粉总黄酮的检测方法并无统一标准。此外，对于蜂花粉黄酮的提取、精制工艺的研究更是少之又少，在国内外基本上为空白。聚酰胺柱层析对各种黄酮类化合物有较好的分离效果，可用于分 离各种类型的黄酮类化合物，广泛应用于石油化工、医药卫生、环境保护等领域，资料显示，聚酰胺柱层析对各种黄酮类化合物有较好的分离效果，可用于分离各种类型的黄酮类化合物，包括苷及苷元、查耳酮与二氢黄酮等。邹淑仙 (2001)采用聚酰胺柱色谱从脓疮草提取物中分离出六种黄酮类化合物。李勇军等（ 2000）采用硅胶和聚酰胺柱层析进行分离，从头花寥中分离出了槲皮素、槲皮苷、陆地棉苷、槲皮素 怡红 (1999)采用改性聚酰胺层析柱分离了银杏黄酮，但未见将聚酰胺柱层析法用于分离纯化蜂花粉黄酮的报道。 聚酰胺层析法的研究 1. 吸附原理： 固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面里，它能从外面吸附分子、原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们把从流动相 (气体或液体 )浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。固体吸附剂自溶液中吸附规律比较复杂，主要是由于溶液中除了溶质之外还有溶剂，因此至少要考虑三种作用力 :即在界面层上于溶质之间的作用力；固体与溶剂之间的作用力以及在溶液中溶质与溶 剂之间的作用力。在达到吸附平衡后，其吸附量不仅受吸附剂的性质、结构、形状、颗粒大小、孔隙的影响，而且于溶液中溶质的性质、浓度、固液两相重量比以及溶剂本身和液相中存在的各有关成分和相互作用强弱有关，并对吸附过程的具体条件如 也有直接影响。解吸是吸附的逆过程，影响吸附过程的因素也会影响解吸过程。吸附树脂对分子的吸附作用力只要改变体系的亲水疏水平衡条件，改变吸附剂与吸附质之间的分子引力，改变介质的介电常数，范德华力就会根本改变，原来的吸附就会崩解，吸附质由吸附剂进入溶剂，成为解吸或脱附的过程。对解吸的要求是吸 附质与解吸剂的亲和力大于吸附剂的亲合力。吸附饱和后的树脂应选用最能溶解吸附质的溶剂进行解吸。选用溶解黄酮效果最好溶剂作解吸剂，最好是水溶性低沸点极性有机溶剂，使解吸剂易于蒸馏浓缩回收，解吸后残留在树脂内部的解吸剂容易被水带出，并且所选解吸剂分子应足够小，易于进入树脂内部，进行解吸，树脂吸附黄酮后，一般用乙醇、甲醇等低沸点的有机溶剂解吸。此法用于除去黄酮类化合物中的水溶性杂质。当含黄酮的溶液通过树脂时，黄酮类化合物被吸附在树脂上，而其它水溶性杂质可用水洗除。然后用不同浓度的甲醇或乙醇将黄酮化合物洗脱下来。从大 体积的稀水溶液中收集黄中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 5 酮类化合物采用树脂法是很适宜的。 树脂吸附法的关键在于所用树脂与花粉黄酮成分有较强的亲合力，而又可用洗脱剂选择性地洗脱。此外还有要求树脂易再生，能反复使用，稳定性好，二次污染小。在实际应用中，适合的吸附树脂不仅具有较大的吸附量和解吸附率，还要有较快的吸附速度。 2. 聚酰胺 是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基。其对物质的分离是建立在氢键吸附的基础上，通过其酰胺羟基与黄酮类化合物分子上的酚羟基形成氢键缔合而产生吸附作用（北京医学院， 1983）。特点是吸附容量较 高，分辨能力也较强 (， 1970)。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。溶剂分子与聚酰胺或黄酮化合物形成氢键缔合的能力越强，则聚酰胺对黄酮类酚性物的吸附作用将越弱。 聚酰胺对黄酮类化合物分离效果的好坏除与所选用的洗脱体系有关外，还取决于所用聚酰胺的颗粒大小。颗粒愈小，分离效果愈佳，但颗粒太小又会大大降低分离速度。 3. 柱层析分离技术 柱层析是常用的现代化分离手段，广泛应用于石油化工、医药卫生、环境保护等领域，其填料的不同 可分离纯化高分子化合物和蛋白质、多糖、多肽以及小分子化合物，利用物质中的各组分在不同的物相体系中表现出的吸附、溶解、亲合作用等热力学和动力学性质的差异，通过吸附层析分离技术是当前植物化学应用最为广泛的分离提纯方法。 粉黄酮类化合物的研究 蜂花粉是由蜜蜂采集的植物花粉，在蜜蜂生长发育阶段用来喂养蜜蜂幼虫的。植物花粉含有种类繁多的黄酮类物质，包括糖苷和糖苷配基以及肉桂酸衍生物等。黄酮类化合物大部分是以糖苷的形式存在，是一个糖分子的一个或多个羟基通过在半缩醛 键与一个非糖分子连接，非糖的部分称为糖苷配基，在体内通过葡萄糖苷酶的作用而产生，是一类具有抗氧化、抗肿瘤、抗过敏、抗炎症等多种生物活性的多酚类化合物。在蜂花粉诸多成份之中，黄酮类物质和他们的生物学活性已成为研究热点，目的是为了以此建立蜂花粉的质量参数，并评估他们的营养和生物学的特征。 1. 花粉黄酮的成分、结构和含量的研究 黄酮类化合物是以黄酮 ( 2图 1为母核，黄酮母核上连有羟基、甲氧基、氢氧基等取代基，是植物经过光合作用产生的，按结构可分为黄酮类 ( 、黄烷醇类( 、异黄酮类 (、二氢黄酮类 (、二氢黄酮醇类 (橙酮类(、黄烷酮类 (、花色素类 ( ，查耳酮类 (、色原酮( 。花粉中黄酮类化合物是其重要的营养成份之一，而且含量丰富。目前从花粉中发现的黄酮类化合物有 :黄酮醇、槲皮酮、山奈酚、杨梅黄酮、木犀黄素、异鼠李素、原花青素、二氢山奈酚、柚 (苷 )配基、芹菜 (苷 )配基等。 中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 6 图 1 2黄酮 ) 早报导从花粉提取出类黄酮，以后日本的久道周次和德国的威尔曼 (都先后报导对多种花粉含黄酮类检测的结果（王开发， 1999）。 黄烷醇类（ 植物花粉中普遍存在，并被证实在花粉发芽和花粉管生长中具有重要的生理学的功能。 研究表明新西兰和葡萄牙的蜂花粉中含有罕见的草质素糖苷， . 1996）发现了新的黄酮醇苷。他们从 欧毛（ 粉中发现了 737从荆豆（ 粉中发现了 838从野萝卜（ 粉中发现了 888这些成 分被证实在花粉发芽和花粉管生长中具有重要的生理学的功能。 通过 究了新西兰的罂粟花粉，证实其含有黄酮醇和类胡萝卜素成分，并认为黄酮类物质对花粉的功效起了重要的作用。 2002）研究了桃金娘科（ 粉，发现其不但含有丰富的黄酮苷配基（ 还有常见的黄酮糖苷（ 有独特的 3， 4， 5， 5， 7此外还发现的微量的黄酮醇双糖苷 （ 这些糖苷对花粉的生物活性起了显著地作用。 2001）对 11 个西班牙蜂花粉样品中的多酚、黄酮和游离黄酮苷元化合物进行检测。通过反相 度洗脱共分离出 15 个成分，在 15 种化合物中鉴别出 13 种，分三大类：（ 1）安息香酸衍生物（ 3,4 二羟基苯甲酸，原儿茶酸， 4羟基苯甲酸乙酯，香兰酸，丁香酸；（ 2）羟基肉桂酸（ 对香豆酸，正香豆酸，反肉桂酸；（ 3）黄酮醇和黄酮（ 芦丁、槲皮素、莰非醇、杨 梅酮、异鼠李素。最主要的成分是黄酮苷元（大多数是黄酮醇）。 82%的样品存在至少 14 种酚类化合物，主要以芦丁、槲皮素、杨梅酮和反式肉桂酸为主。用分光光度法以芦丁为标样测定黄酮含量大于 00g。 i （ 2004）分析了西班牙不同的养蜂区域收集的五个样品，用带有二极管阵列和 测器的 定了花青素成分。鉴别出八种花青素，最主要的是矮牵牛配基 还有飞燕草苷元（ ,花青素（ 矮牵牛配基 ,芍药色素（ 锦葵苷元 花青素 6” 6 研究表明收集区域之间的地理差异可引起花青素含量的微小变化。 花粉中黄酮类是不低的，一般达 g/100g。我国早在 1983 年由湖南中药研究所从长苞香蒲花粉 中分离出异鼠李素、槲皮素、异鼠李 粉中芦丁含量比较丰富，如荞麦花粉 17 g/100g、榛树花为 25 g/100g 等。槲皮素、山柰酚、异鼠李素在多种花粉中均有报道。特别是对郁金香等花粉的研究十分深入，已鉴定出 6中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 7 种黄酮醇类化合物。任玉翠等（ 1990）对 12 种花粉（ 100g)进行分析，得出油菜蜂花粉黄酮苷含量最高 瓜最低 同的花粉总黄酮含量差异很大，高者达 9%，低者为 其中含总黄酮丰富的花粉为：板栗、茶花、蚕豆、飞龙掌血、 紫云英、芸芥、胡桃等。刘嘉宝（ 2001）鉴定出云南松花粉的黄酮类化合物成分主要为黄酮和黄酮醇类，其次是二氢黄酮醇类，另外还有少量黄烷醇类的花青素。 2. 花粉黄酮测定方法的研究 黄酮是蜂花粉中重要的功效组分，也是保健食品中的有效成分。由于蜂花粉黄酮类化合物的种类多，黄酮苷含量的准确测定比较困难，目前还没有完全统一的标准。国内外学者对黄酮类物质的定量分析方法较多，有比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱 胶束毛细管电泳法 (高效液相色谱法（ 高效液相色 谱 胶束毛细管电泳法 (定结果比较准确、分离效果好，各有自己的优点，但是仪器设备昂贵，所以很难被普遍采用。在花粉黄酮的检测方法中，以比色法、紫外分光光度法和 研究较多。 （ 1）比色法 比色法 是在碱性溶液中加 35用颜色和含量关系进行比色测定的方法。这是早期常用的方法，由于此法设备廉价，操作简单，现在国内有许多文献报道的仍然采用此法。如：梁惠花等（ 2003）以芦丁为对照物，测定油菜蜂花粉中总黄酮含量为 (，平均回收率为 n=6)。魏永生等（ 2004）以芦丁为对照物，测定出总黄酮平均含量为 王开发等（ 2004）测定马来西亚的油棕（ 粉油棕黄酮类含量为 100g。 比色法用于组成单一的标准对照物时，结果准确，但当应用于组成复杂的植物试样时，比如花粉黄酮提取液，由于受到花色素、鞣酸及其它酚性成分等多种物质的干扰，而且底液常常出现混浊现象，因此测定结果明显偏高，而且测定结果重现性不好。为克服底液强 吸收带来的干扰，研究人员对传统的比色法进行了改进，陈郑镔（ 2004）在使用传统的硝酸铝显色法时先用聚酰胺对样液进行吸附，以减少非黄酮类物质的显色干扰。郑敏燕（ 2004）采用双波长分光光度法，使用 510 测定波长， 584 参比波长，采用比色法测定油菜蜂花粉中的总黄酮平均含量为3. 22%，平均回收率 98. 2% , 1. 23% ( n= 5)，由于扣除了底液混浊等背景干扰，取得了满意的实验结果。 （ 2）紫外分光光度法 紫外分光光度法 是利用黄酮类化合物在紫外区有较强吸收，采用适当的对照品 进行总黄酮的测定。 2001）以芦丁为标样测定西班牙蜂花粉中黄酮含量大于 00g。为了消除一些水溶性大的强极性物质的干扰，将样品用聚酰胺进行了分离提纯，再采用紫外分光光度法测定，此为聚酰胺 嘉宝（ 2001）以黄芩苷为标样，波长为 278聚酰胺 果表明破壁云南松花粉中总黄酮含量达到 51000g。此法优化了单纯的紫外分光光度法，提高了测定结果的准确性。 中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 8 （ 3）高效液相色谱法 一种方法是采 用样品直接进样，梯度洗脱，高效液相色谱分析，测定样品所含黄酮苷类成分。魏永生等（ 2004）以槲皮素、山奈酚、异鼠李素为对照品，采用 ，测定出青海油菜蜂花粉中黄酮类化合物平均含量为 由于黄酮苷种类多，不可能一次分离，而且很多都没有标准对照物可对照，很难定量。 另一种方法是通过测定水解苷元含量来计算黄酮苷的量。此法是 20 世纪 90 人提出的，其测定原理是 :蜂花粉黄酮主要成分是以黄酮苷形式存在，经酸水解后生成黄酮醇类化合物，其主要是槲皮素、异鼠李素和 山奈酚三种组分。用 离测定这三种苷元的含量，再用计算方式转换成相应 :蜂花粉黄酮苷的含量。郑敏燕（ 2004）将黄酮提取物中的黄酮苷水解为黄酮苷元后，利用 测定其中槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量，结果表明，青海油菜蜂花粉中槲皮素、山奈酚、异鼠李素的平均含量分别为 、 、换算成总黄酮含量为 虽然测定的仍然是近似值，但该方法灵敏度高，重现性好，结果比较准确。不过由于水解方法、测定波长、计算方法不同所得结果也有差异。 M G（ 1997）和 F（ 1989）研究证实；每一种花粉都有自己独特的黄酮类或酚的 线，可以通过 谱与标准花粉的 谱进行比较检测出来。花粉中黄酮和其它酚类在种类和含量上的差异，可以导致作为抗氧化剂或清除自由基效果的不同。 3. 花粉黄酮提取方法的研究 文献中有很多关于黄酮类化合物提取方法的研究，如水提法（仅限于黄酮苷类物质）；碱性水或碱性稀醇提取法，其原理是将具有酚羟基的黄酮类物质用碱水或碱性稀醇浸出，经酸化后得出黄酮类物质；有机溶剂提取法，这是国内外使用最广泛的方法。有机溶剂主 要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等。此方法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类物质，对设备要求简单，产品得率高，但成本较高，杂质含量也较高。常见的可以分为三种方法 :冷浸法、渗漉法、回流法。王兰珍等（ 1997）人用 70%乙醇冷浸从元宝枫叶粉中提取黄酮类物质，提取率和黄酮含量都很高，提取物易于浓缩和干燥；李苑等（ 1999）以 50%或 60%乙醇按 16:1（ V/M）的比例，用渗漉法提取陈皮苷等黄酮类物质效果最佳；用回流法从水飞蓟中提取水蓟宾，其纯度比较高（陈毓茎，1997）。微波法：其原理是利用磁控管所产生的每秒 次超高频率的快速震动，使物料内分子间相互碰撞、挤压，有利于药材有效成分的浸出。此法对黄酮类物质的提取也取得了不错的效果，具有反应高效性和强选择性等特点，操作简单、副产物少，产率高及产物易提纯等优点。范志刚等（ 2000）人用微波法提取雪莲中黄酮类物质，提高了雪莲的利用率。酶解法：一般用于黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的物料。其原理是能够充分破坏以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶，使植物中的果胶完全能够分解成小分子物质，减小提取的传质阻力，使物料中的黄酮类物质能够充分地释放出来。王晓等（ 2002）人用复合酶提取山楂叶中黄酮类物质，提取率比常用的方法提高了 2%超临界萃取法：超临界 取技术是以 溶剂进行提取的，是一种不同于传统黄酮类物质提取的新工艺，它的提取率与提取温度、提取压力、 其它工艺相比较，该技术具有提取率高、无残留溶剂、无污染，活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏的特点。同时，还可以通过控制临界温度和压力达到选择性提取和分离纯化的目的。缺点是超临界提取所需设备价格昂贵、生产成本高、提取物中烷基酚含量较中国农业科学 院硕士学位论文 第一章 绪 论 9 高、对极性大的物质提取不理想。目前还难以进行 规模化生产，但本法在生产银杏黄酮的技术上取得了重大突破（王欣， 2000），中科院生态环境研究中心同相关单位合作，用此法提取银杏黄酮获得成功，得到黄绿色精提物，收率 含黄酮类 35%以上（骆祥峰， 2000）。陈从贵等（ 2002）研究探讨超临界 出溶剂浸提与超临界相结合的生产工艺，既可降低生产成本，保证产品质量，又可大幅度降低设备造价，为超临界液体萃取技术的应用创造条件。 在已查到的国内外文献中花粉黄酮的提取方法只涉及到了醇提法。如魏永生等（ 2004）采用正 交试验设计研究了青海油菜蜂花粉中黄酮类化合物的最佳提取条件，即选用 95%的乙醇作为溶剂以 10 倍总量的乙醇用量，水浴热回流提取。郑敏燕（ 2004）以 95%乙醇为溶剂，采用索氏提取器提取青海产油菜蜂花粉中的黄酮类化合物。 4. 黄酮类化合物分离纯化的研究 黄酮类化合物的分离纯化方法很多，有柱层析、薄层层析、铅盐沉淀、硼酸络合、梯度萃取、溶剂萃取以及近年来应用的高效液相色谱、液滴逆流层析、气相层析、微乳薄层色谱等。柱层析法：李文魁等（ 1996）以甲醇 聚酰胺层析柱法对各种黄酮苷类进行分离，取得了 很好的效果，而且层析量大，适合制备性分离 ; 个黄酮和黄酮苷， 人已用此法分离出具有抗血小板活性的黄酮单苷（张睿，2003），李教社等（