【毕业学位论文】（Word原稿）小尾寒羊5个与繁殖和疾病抗性相关基因的克隆及比较基因组学分析动物遗传育种与繁殖博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小尾寒羊 5 个与繁殖和疾病抗性相关基因 的克隆及比较基因组学分析 5 I 摘 要 绵羊作为世界上重要的可再生资源，在农业生产中占有重要的地位 。在鸡、牛和猪已经完成初步的基因组测序的情况下， 绵羊基 因组 的 研究现状 呈现明显的滞后状态 。 基于比较基因组学的研究手段， 在基因组图谱和测序的基础上，利用模式生物基因组研究中获得的信息推测 畜禽品种中的基因数目、位置、功能、表达机理和物种进化 ，可以实现 对 畜禽品种 重要经济性状 候选 基因的鉴定、克隆和特性的认识。本课题尝试在中国地方绵羊品种的功能基因组研究中引入比较基因组的 研究方法 ，进行绵羊繁殖和疾病抗性相关基因的克隆，为中国地方绵羊的选育和品种资源保护提供理论依据，并用以指导绵羊品种的分子育种和品种资源的保护工作。 本实验 共 克隆了绵羊 羊和山羊 个 基因，并对 各个 基因 进行了比较基因组学分析 ，结果如下： 绵羊 长 1449o. ， 867 核苷酸，可编码 288个氨基酸，该蛋白具有典型的 构域，氨基酸序列与人、犬、小鼠、大鼠、黑猩猩、恒河猴等的一致性均在 95%以上。 绵羊 动子 ， 5 录因子的结合位点。多物种的 转录因子结合位点分析表明， 因转录表达调控的复杂性与物种进化复杂程度可能存在一定的相关性。 43 个 物种 其直向同源物 蛋白的聚类与生物进化的方向基本一致， 并且蛋白的 3构也同样保守，但 各物种 非翻译区 在基因调控及表达中发挥了不同作用，从而 在 进化方向 上存在一定差异 。 建立了高效的绵羊 核表达体系，为进一步获得抗血清并应用到 白功能研究奠定了基础 。 小尾寒羊睾丸和卵巢中 共 克隆了 75 个非冗余的 择性剪接产物 克隆，其中卵巢组织中26 个，睾丸组织中 49 个，涵盖了 5 端或 3 端的选择性剪接、外显子跳跃及内 含子保留等 3种主要的剪接方式。 其中 34 条编码的氨基酸残基超过 20 个 ， 根据编码产物 析的结果 可将 其 分为 6 组。第一组共 10 个选择性剪接产物（卵巢中 1 个，睾丸中 9 个），编码蛋白均为 端结构域。第二组共计 17 个（卵巢中 4 个，睾丸中 13 个）与犬中存在的另一种择性剪接的蛋白序列一致性达到 94%。第三组共 3 条序列，第四组共 2 条序列 ，均为睾丸中的选择性剪接产物，功能未知 。第五组序列为 1 条， 12 个 多物种 C 段结构域存在 85%的一致性。 第六组序列为卵巢中的 1 条选择性剪接方式 ， 功能未知 。 绵羊 因在不同 生殖系统 中可能存在大量的非编码 睾丸非编码 42%（ 21/49），卵巢的非编码 84%（ 22/26）。 7 条 150下的 增产物的 级结构预测呈现一种类似的“茎泡”样结构，并随着序列碱基数目增加在主茎环结构外也增加了其他茎环结构，使整体的二级结构呈现“十字”型变化。 小尾寒羊 和 济宁青山羊 分别 为 103311由两个外显子构成。 绵羊 94%、黑猩猩 77%、人 77%、恒河猴 77%、小鼠77%。蛋白的相似性分别为牛 87%、黑猩猩 66%、人 66%、恒河猴 67%、小鼠 63%。多物种的 在 2个泛素同源结构域，并且其 3 显示出较高的相似性。 已克隆的小尾寒羊 序列在 904个 13个 失 突变，由此造成小尾寒羊 的 47425码氨基酸残基的个数也从 照 序列 57个氨基酸残基变为 174个氨基酸残基 ，3短为 19宁青山羊的 02码 133个氨基酸残基 。 启动子区分析显示该基因为无 除犬 41+45物种23+27。 小尾寒羊和济宁青山羊的 ）缺失的现象，使其 末端结构并不存在 序列。 绵羊基因组中 因 克隆产物长 4192 括 115 52个 4 3尾寒羊 其他哺乳动物 96%，猪 87%，马 86%，猫 85%，犬 85%，人 83%，黑猩猩 83%，恒河猴 83%，大鼠 78%，小鼠 77%，和 负鼠 70%。 95%，猪 85%，马 83%，猫84%，犬 83%，人 79%，黑猩猩 79%，恒河猴 79%，大鼠 72%，小鼠 73%，和 负鼠 60%。多物种 能 域 在数量、种类及相对位置上 均有不同，因而造成恒河猴和小鼠在多物种 能域 聚类 分析 与基因的系统进化树的聚类的位置上存在差异。 绵羊基因组中 因 克隆产物长 4927 括外显子 28和 493 3在绵羊的精子和卵子发生过程中， 基因转录、 因组扩增产物为 3括 7 个外显子及 50 5 189 3增产物 799 576码 191 个氨基酸。 多物种 常保守， 绵羊与其他物种的 列一致性分别为与牛为 98%，犬 95%，人、恒河猴、大鼠和小鼠均为 93%。 白分子量为 电点为 有与其它哺乳动物相同的 构域，与其他物种的相似性分别为，牛 97%，犬和恒河猴 87%，人 88%，大鼠和小鼠 85%。 关键词 绵羊 比较基因组学 繁殖性状相关基因 疾病抗性相关基因 基因克隆 s an in in In on on of be to of in So be We to of on to in to or by of as 449bp in o. 67 88 is of SD of 5%. of of of 3 to -D of in to or We 5 6 9 S 34 S in 0 to be in S(1 0 4 3 7 of S of 12 AA on 5% of a of in 21/49) 22/26). S 50bp S 033bp 11by 4% 7%, 7%, 7%, 7%. 7% 6%, 6%, 7%, 3%. to -D a G 04a G 3bp 2574902749PE of 41+4523+27 of a in 19215 2 34 6% 7%, 6%, 5%, 5%, 3%, , 3%, 3%, 8%, 7%, 0%. 5% 5%, 3%, 4%, 3%, 9%, , 9%, 9%, 2%, 3%, 0%. on a in 927of to , 493 on NA Kb in 50 7 189 99918% 5%; 3%. of is of 7% 5%; 8%, 5%. V 目 录 第一章 比较基因组学及应用 . 1 间比较基因组学研究 . 1 列比对的工具与策略 . 1 基因组的比较研究 . 3 统发生的进化关系分析 . 3 因的预测 . 4 因组中非编码区域的结构与功能研究 . 4 内比较基因组学研究 . 5 核苷酸多态性 . 6 贝数多态现象 . 7 因组内的结构变异研究 . 8 语 . 8 第二章 材料与方法 . 10 验材料 . 10 验动物及采样方法 . 10 要仪器设备 . 10 要试剂 . 11 酸提取 . 12 取 . 12 取及反转录 . 13 隆及测序 . 15 株和载体 . 15 肠杆菌感受态细胞制备 . 15 粒提取 . 16 粒纯化 . 17 切、目的片断回收及连接转化 . 17 组质粒的快速筛选 . 18 列测定 . 19 第三章 不同物种 因结构及其系统进化分析 . 20 言 . 20 基因和蛋白结构 . 20 定位和作用方式 . 21 功能 . 22 降解 . 24 料与方法 . 25 羊 因全长 隆 . 25 序列选取 . 25 列比对 . 26 列分析 . 26 白质 3构预测 . 27 果与分析 . 27 羊 因克隆与序列分析 . 27 动子和转录因子结合位点分析 . 27 同物种 码区、 5 3统进化树分析 . 28 基因在哺乳动物中的分布及序列比对 . 32 白质 3构比较 . 32 论 . 34 因的进化 . 34 白 3构和功能之间的关系 . 35 激蛋白与热休克蛋白之间的关系 . 36 第四章 小尾寒羊 因的原核表达 . 38 料和方法 . 38 织来源 . 38 体与菌株 . 38 取和纯化和 一链的合成 . 38 . 38 物克隆、鉴定与序列分析 . 38 组表达质粒 建 . 38 合诱导表达 . 39 定 . 39 果与分析 . 40 因 克隆与序列分析 . 40 核表达载体构建与诱导表达 . 40 论 . 41 第五章 小尾寒羊 丸和卵巢组织中选择性剪接方式研究 . 42 料和方法 . 43 取和纯化和 一链的合成 . 43 长产物扩增 . 43 物纯化与克隆、测序 . 43 列分析 . 43 果与分析 . 43 长引物的扩增及克隆 . 43 接方式分析及 物预测 . 47 长小于 150剪接方式编码产物 二级结构预测 . 54 论 .