【毕业学位论文】（Word原稿）转BoTMT基因大豆的获得及鉴定作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 转 因大豆的获得及鉴定 i 摘 要 生育酚（ 称维生素 E，是仅由光合生物合成的一类脂溶性的强抗氧化物质，为人体所必需。在天然存在的 4 种生育酚中， 物油是人类膳食中 但在大多数植物油中， 生育酚含量较高。例如，大豆油中 %，而 0%，这一现象与 生育酚甲基转移酶（ 活性有关。本课题组合作单位 中国科学院微生物研究所从结球甘蓝（ 中克隆了 列（命名为 体外原核表达实验表明，达的蛋白质具有 有效地催化 生育酚。本课题组为培育高 构基因克隆到质粒 ，构建了植物组成型表达载体 种子特异性表达载体 本研究在上述工作基础上，利用植物组成型表达载体 种子特异性表达载体大豆子叶节为外植体，用农杆菌介导法转化大豆，以期获得 验期间共获得再生植株 330 株， 其中转 203 株，转 127株。在以上再生植株中， 测呈阳性的有 58 株，其中转 31 株，转 27 株。通过 测发现 4 株呈阳性反应，初步说明 整合到 大豆的基因组中并有效表达。在 中，有 10 株 测呈阳性， 初步证明外源基因已遗传给后代。上述研究结果为进一步获得高产 此外，本 文 还优化了农杆菌介导子叶节转化体系，发现在种子灭菌时，氯气熏蒸灭菌法优于升汞灭菌法；比较了吉林小粒 1 号、 3 个品种的再生效率，发现吉林小粒 1 号的再生能力 最强、其次为 弱；在共培养基中添加 胱氨酸和 加光培养处理，可以减轻子叶节的褐化。 关键词： 大豆， 杆菌介导 ，子叶节 as , a of by In to as Of is is of is as a is at in to is in of To - by at in to in To in By as we in to 30 27 to be CR of 0 T1 we of It o.1 we 6001 of of i 目 录 第一章 绪 论 . 1 然维生素 E 合成途径研究进展 . 1 然维生素 E 在植物中的作用 . 2 然维生素 E 的生物合成途径 . 3 然维生素 E 生物合成的调控以及基 因工程 . 4 望 . 7 豆遗传转化研究进展 . 8 豆转化的再生系统 . 8 豆遗传转化的方法 . 9 豆遗传转化应用研究现状 . 13 记基因的消除 . 14 豆遗传转化的展望 . 15 研究的意义、主要内容及技术路线 . 15 题意义 . 15 究内容 . 16 术路线 . 17 第二章 材料与方法 . 18 验材料 . 18 物材料及菌株 . 18 源基因及其质粒载体 . 18 织培养相关培养基 . 19 源基因 定的引物 . 19 器 . 19 要试剂 和药品 . 19 法 . 20 粒的 定 . 20 豆的转化流程 . 21 豆转化流程的优化 . 22 生植株叶片的离体抗性检测 . 22 基因大豆 测 . 22 性植株的 测 . 23 第三章 结果与分析 . 26 粒的 定 . 26 豆的转化及再生 . 26 杆菌介导子叶节转化体系的优化 . 28 子消毒方法的比较 . 28 同品种再生频率的比较 . 28 基混合物 对子叶节丛生芽诱导的影响 . 29 0代再生植株叶片的巴龙霉素离体检测 . 29 生植株 测 . 30 转 生植株的 测 . 30 生植株的 测 . 31 1 代植株的 测 . 32 0代转 株的 测 . 32 第四章 讨论与结论 . 33 论 . 33 基因植物的研究 . 33 杆菌介导大豆子叶 节体系优化 . 33 一步解决的问题 . 34 论 . 35 参考文献 . 36 致 谢 . 46 作 者 简 历 . 47 中国农业科学院硕士学位论文 绪论 1 第一章 绪 论 植物 遗传转化 技术 （ 是指通过一定的方法将从动物、植物或微生物中分离 得到 的目的基因转移到植物的基因组中，使之表达并 稳定遗传，从而赋予植物新性状的技术。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴未艾。自 1994年转基因延熟番茄 和 抗草甘膦转基因大豆 品种 在美国获得商业化生产许可以来，转基因植物的种植面积迅速 扩大 。 从 1996至2005年的 10年间，全球转基因作物的种植面积增加了 50多 倍， 2005年 达到 9000万公顷 。 目前 ， 至少已有 21个国家进行了转基因作物的商业化生产 。 在各种转基因作物中，转基因大豆的发展速度最快，应用面积最广。 2005年，全球转基因大豆的种植面积已达到 5440万公顷， 约 占全球大豆种植面积的 60%， 占当年 全球转基因作物种植面积的 60%。 其中， 美国是种植转基因大豆最多的国家。 2003年，美国转基因大豆面积达 6000万英亩（合 2400多万公顷），占该国大豆种植面积的 81%，其中有 5500万英亩（合 2200万公顷）为抗草甘膦的转基因大豆 。 除抗草甘膦的转基因 大豆 外，还有 抗草丁膦大豆 （ 、抗虫（ 大豆、 高油酸 （ 80%） 大豆 、 低亚麻酸 （ 2%） 大豆 、低棕榈酸（ 4%）大豆、高硬脂酸 （ 28%） 大豆、高棕榈酸 （ 27%） 大豆等转基因 品种 (003） 。 中国是大豆起源国和主产国之一 。 2005 年，中 国大豆种植面积和总产均居世界第四位，单产约为世界平均水平的 70%左右 。由于市场需求量巨大，国产大豆 远远 不能满足需要， 目前我国已是世界上最大的大豆进口国， 2005 年进口量 估计已超过 2800 万吨， 超过我国 大豆消费量的 60%，其中大部分为转基因大豆 。 因为 转基因大豆具有明显的优点，可以明显降低农民的生产成本、增产增收，同时未发现存在食品安全上的问题，因此，加强我国转基因大豆的自主研发能力已成为非常迫切的国家需求。 然维生素 E 合成 途径 研究进展 天然维生素 E 是一 组在苯环上有 多个甲基 ， 紧密相关的酚的苯 并 二氢吡喃 衍生物 （ 蒋明义，1993）。根据其侧链饱和度，分为生育酚和三烯生育酚两类。每类根据甲基的位置和数目不同又可分为： -、 -、 -、 个甲基， 有 2 个甲基，而 个甲基。这八种结构 ，在体外都有抗氧化剂能力，但它们的生理活性却差别很大，其中 -、 它们的基本结构以及生理活性如表 1示。这种生理活性的差别不是由于在消化过程中 事实上， 八种结构可以被等同吸收，而是 生育 酚转移蛋白（ 先保留，因此表现出 ， 1996 年）。然而有趣的是，当对它们的抗氧化能力进行比较时，发现 生育酚次之， 1999）。 中国农业科学院硕士学位论文 绪论 2 类型 生育酚生理活性 三烯生育酚生理活性 - 100 21 50 - H 25 50 5 - H 8 19 未 测量 - H H 3 未 测量 表 1生育酚以及三烯生育酚的结构 和 生理活性 天然维生素 E 在植物中的合成部位 尽管天然维生素 E 在人体和动物中有着重要的功能，但是它仅在光合生物体 （所有的绿色植物以及一些蓝色细菌中） 中合成。生育酚的含量和组分在不同植物及组织中的差异很大。植物每克鲜重绿色组织中含有 10 50 g 的生育酚和 三烯生育酚 ， 其中 说明高含量的 绿色 组织不同，植物的 非绿色组织（如大多数油料作物的种子） 含有高浓度的总生育酚，但其中 、 1999）。针对 这种有意思的现象，人们提出了几种改善生育酚含量和组分的策略： 1）针对绿色植物组织，通过改变 天然 维生素 的总量； 2）针对油料植物的种子（像大豆等），改变四种生育酚的相对比例， 使 形式（ 2004）。 然维生素 E 在植物中的作用 天然维生素 E 是强抗氧化剂，可保护 生物膜。生育酚和 三烯生育酚均能清除脂类过氧自由基，保护脂类物质和一些其它膜成分 , 使膜免受脂类过氧化物的伤害， 维护生物膜的完整性。 其中 叶绿体中的 除单线态氧的能力为 的正常合成创造了有利条件，这对类囊体膜的电子传递起重要作用 。 是直接和信号传导过程中的重要物质相互作用；或者是间接地，通过阻止脂质的过氧化或清除单线态氧来影响细胞内信号传导过程。对于后者， 茉莉酸）的浓度来发挥作用的 ( 2002） 。 在分离和鉴定 拟南芥突变体 及 发现，它们的种子的生命力低，表明生育酚 对 维持种子的生命力有重要作用，同时还发现，在种子发芽以及幼苗阶段生育酚可明显减少脂质的氧化（ ， 2004）。 生育酚 三烯生育酚 中国农业科学院硕士学位论文 绪论 3 然维生素 E 的生物合成途径 在天然维生素 E 中，生育酚合成途径已经研究清楚。早在 20 世纪 60 70 年代，研究者就通过放射性同位素标记技术研究 ， 2002）。到 20 世纪 80 年代已基本上阐明 ， 1985）。目前，研究者已完全弄清生育酚的生物合成途径（图 1示）。 生育酚的合成前体来自于两种途径： 1）质体的 非甲羟戊酸途径（ 通过该 途径生成生育酚的疏水尾部叶绿醇焦磷酸 （ ， 异戊烯 基焦磷酸 （ 该途径的前体物质。 构酶的作用下生成 二甲基丙烯基二磷酸 （ 然后再与 3个 合依次生成 牻 牛儿基焦磷酸 （ 法尼基二磷酸 （ 牻 牛儿基 牻 牛儿基焦磷酸（ 三烯生育酚、赤霉素、叶绿素、类胡萝卜素及质体醌侧链的共同前体。随后在 原酶的作用下逐步还原而形成叶绿醇焦磷酸（ ， 1998） ； 2）胞液的莽草酸合成途径 (，通过该合成途径生成 生育酚的芳香环头部 尿黑酸 （ 。它是由对羟甲基丙酮酸双加氧酶 （ 催化对羟甲基丙酮酸 （ 化、脱羧、异构后 生成的，尿黑酸是生育环和质体醌的共同芳香环前体 (， 2003） 。 生育酚 及三烯生育酚生物合成的第一步是 叶绿醇焦磷酸以及 尿黑酸叶绿醇转移酶（ 作用下发生异戊二烯化，分别生成生育酚合 成的中间体 262及三烯生育酚合成的中间体 262- 底物的特异性结合决定了在生物体内生成生育酚还是三烯生育酚。 生育酚合成的第二步是环的甲基化和环化。 是生育酚环化酶的底物又是2- 4基转 移酶的底物，这两个酶分别由 因编码。 基 转 移 酶 (2T） 甲基化 及 别生成 2,351,4质体醌（ 基转移酶是唯一一个生育酚合成途径中参与质体醌合成途径的酶。进而，生育酚环化酶 (使 、 后 酶由 因座编码）使芳香环的 甲基化，使、 ， 2004）。 中国农业科学院硕士学位论文 绪论 4 尿黑酸叶绿醇转移酶； 基转移酶； 育酚环化酶； 然维生素 E 生物合成的调控以及基因工 程 近年来， 随着遗传学技术和基因组学技术研究的迅速发展， 维生素 E 生物 合成途径的研究也取得 显著的进展。合成途径的关键酶的基因已经从模式生物蓝藻聚球藻（ 拟南芥中被克隆出来，并对其进行了详细的研究。除 26T）基因外，其它核心酶的基因在拟南芥和蓝藻聚球藻中有很高的同源性。这种序列的同源性以及生育酚合成途径关键酶编码基因常位于同一个操纵元的特性，使得在这两种模式生物中分离和克隆这类基因变的较为容易（见表 1毫无疑问， 这些基因的克隆大大有助于我们在分子和生化水平上研究和调控生育酚的合成，从而实现在重要农作物上改变它们生育酚水平的目标。 图 1生育酚生物合成途径 (摘自 ， 2003） 中国农业科学院硕士学位论文 绪论 5 表 1南芥以及蓝藻聚球藻编码生育酚合成途径相关 酶的基因位座 in 成途径的酶 拟南芥基因 /位座 蓝藻聚球藻基因 T C 羟甲基丙酮酸双加氧酶基因（ 对羟甲基丙酮酸 双加氧酶（ 化对羟甲基丙酮酸（ 氧生成尿黑酸（ 该酶是 因座表达的产物。通过对拟南芥 变体的研究证明 植物体内生育酚和质体醌的合成所必须的（ ， 1998）。有趣的是，在蓝藻聚球藻中，该酶的突变体却仅影响生育酚的合成，并不影响质体醌的生物合成。这一现象充分表 明在蓝藻聚球藻存在另一 质体醌的代谢途径（ ， 2002）。将 拟南芥中过量表达，该酶的活性增加了 20 倍，转 南芥的种子和叶子中生育酚的含量分别增加了 15%和 30%（ ， 2002）。 （ 2005）将 烟草胞液或质体中过量表达，种子中生育酚含量得到相当程度的增加。但用茉莉酸等物质处理拟南芥并诱导上游基因 氨酸氨基转移酶基因 ） 的过量表达，叶中总生育酚的含量没有什么变化（ 2002）。上述数据表明 活性不会限制拟南芥以及烟草中生育酚的流量。 黑酸叶绿醇转移酶 基因 （ 化叶绿醇焦磷酸（ 尿黑酸（ 缩合，这是生育酚合成途径的关键步骤。生育酚的生物合成提供异戊二烯基团，而三烯生育酚的异戊二烯基团则是由 供。模式生物蓝藻聚球藻以及拟南芥全基因组测序的完成，为 离和鉴定提供了有力的工具（ 2001； ， 2002）。 由于尿黑酸叶绿醇转移酶与叶绿素合成酶 (都以异戊二烯 底物，二者的序列有很大的同源性。应用蓝藻聚球藻的叶绿素合成酶基因（ 基 因库中进行搜寻，其中候选基因之一 0%同源性。利用同源重组技术使 变，结果导致所有的生育酚以及中间代谢物缺失（ ， 1996； ， 1997）。随后拟南芥 从 库中被克隆出来。将 拟南芥 大肠杆菌中表达，证实了二者具有 活性。尽管体外实验表明蓝藻聚球藻 以利用 为底物，但是聚球蓝藻却不能积累三烯生育酚。 在拟南芥 种子和叶 中，几乎完全不能合成生育酚，表明在拟南 芥中 参与生育酚合成的唯一的酶。将 化到拟南芥中，使其过量表达，结果种子 和 叶 中生育酚水平分别增加了 5 倍和 2 倍，表明该酶为生育酚合成的限速关键酶（ 2001）。将 拟南芥的叶和种子中过量表达 , 增加 活性，使总生育酚的含量明显增多，中国农业科学院硕士学位论文 绪论 6 同时 大量的 生育酚，拟南芥种子中维生素 E 的生理活性也增加了 12 倍（ 2003）。 底物特异性结合是生成生育酚还是三 烯生育酚的一个关键因素。尽管 大肠杆菌中不能表达出有活性的酶，但是在拟南芥、烟草细胞培养，以及玉米胚胎中过量表达该基因都能导致各种三烯生育酚含量的增加。因此这些酶命名为尿黑酸 牻 牛儿 牻 牛儿基转移酶（ 值得注意的是，将大麦 拟南芥叶（不能合成三烯生育酚）中过量表达，导致叶 中的三烯生育酚含量提高了 10 15 倍，转基因拟南芥叶 中生育酚的含量却没有受到影响，这说明大麦 活性对 特异的。将大麦的 化到玉米胚（三烯生育酚的积累水平较低）中，使该基因过量表达，导致三烯生育酚的含量比野生性种子中增加 4 6 倍（ ， 2003）。 基化酶基因 （ T 以及 尽管两个甲基化酶 T 和 影响生育酚和三烯生育酚 的总量，但它们的活性以及底物的特异性决定了生育酚的组分。 利用基因组学的方法从蓝藻聚球藻中克隆了 蓝藻聚球藻的基因库中找到 1 个与 有 35%氨基酸序列同源的开放阅读框（ 其编码蛋白的 氨基酸序列具有甲基转移酶的结构特征，与已知的植物 -（ 2,4） C 甲基转移酶有较高的同源性 。在缺失掉该 突变体中没有 生育酚。随后利用蓝藻聚球藻 拟南芥的 据库中找到了 1 个氨基酸同源性达 66%的隆，并在大肠杆菌中证实 二者都可以表达 推导的蛋白质序列具有 结构特征： 2 个 1 个 为研究 决定种子生育酚组分中是否具有重要的 酶活性，将 拟南芥种子中过量表达后，使 %上升到了 85% 95%，与野生型相比 0 倍， 天然 维生素 E 的生理活性增加了 9 倍。但并没有改变总生育酚的水平（ 1998）。 （ 2003 年）根据此前克隆的 源性，从蓝藻聚球藻基因组中获得了 26基转移酶基因 传学和生化研究表明 开放阅读框编码 1 个 T。该基因的突变体 积累 外酶活分析显示该酶能有效地催化 上 者形成质体醌。 蓝藻聚球藻T 是在唯一的在质体醌合成代谢途径有活性的酶，并且不能使 据报道，两个不同的研究小组用 理创造拟南芥突变体，并且用 定叶 和种子中生育酚的含量，分离出了该基因的功能缺失体（ 生育酚组成发生了明显的变化，叶 中的、 生育酚的含量相应的减少；种子中 和降低 基转移酶活性的结果相一致。随后利用图位克隆的方法克隆了编码 基转移酶的基因（ 有 构域序列， 甲基转移酶中共有的保守序列。比对 蓝藻聚球藻 T 氨基酸，两者相同的氨基酸不到 20%，这些氨基酸都存在于 合结构域的基序中。然而这两个酶在生中国农业科学院硕士学位论文 绪论 7 育酚和质体醌的合成途径中有相同的底物。拟南芥 及鱼腥藻 T 转化到 变体的质体内，可互补突变体的表型。表明高度趋化的蛋白质在 功能上有很高的同源性。拟南芥蓝藻细菌 T 很低的同源性，表明该基因在生育酚合成途径中有着不同的进化途径 (， 2003 ； ， 2003 ） 。 (2003） 将该基因在大豆种子中的特异表达明显改变了生育酚成分。、到总生育酚含量的 75% 85%；相反， 生育酚的含量非常低，只占总生育酚的 表明 T 编码的的 T 将 生育酚。拟南芥 转基 因大豆种子中的特异表达使得 生育酚含量明显下降，而 生育酚含量有相应的上升。 T 和拟南芥 大豆种子的同时表达导致了种子中 5%，增长了 8 倍，相当于维生素 E 生理活性增长了 5 倍，这些数据说明了T 和拟南芥 时过量表达能导致各种生育酚芳香环 的同时甲基化，因而导致了种子中 几乎 全部的生育 类型都转变成了 育酚环化酶基因（ 生育酚环化酶的编码基因最先在拟南 芥中分离出来的，随后从 蓝藻 聚球藻中克隆出来（ ， 2002， ， 2003）。该基因的突变导致叶子和种子中生育酚合成代谢途径中间体 积累。利用染色体步移的方法从突变体中克隆到了该基因。在大肠杆菌中进行的原核蛋白表达 ， 证实了其具有生育酚环化酶的功能。在蓝藻聚球的基因库中找到与拟南芥生育酚环化酶基因（ 源的基因（ 该基因 于相同的操纵元中。令人惊奇的是，比拟南芥 前 2 年被克隆出来的玉 米的生育酚环化酶基因，并不是基于生育酚的合成克隆出来，而是在研究玉米的胞间连丝的突变体时获得的（ ， 2001） 。该突变体（ 表现为发育迟缓，积累花青素，叶中含有大量的可溶性糖和淀粉。 克隆出来后发现该基因编码 1 个未知功能的质体蛋白，研究者提出假说该蛋白可能参与质体的信号转导 ， 同