拜发试剂盒 酶联免疫法快速定量检测维生素B12 说明书.doc

拜发试剂盒 酶联免疫法快速定量检测维生素B12RIDASCREENFAST Vitamin B12 体外诊断试剂 储存温度 2 - 8 C 拜发分析系统销售（北京）有限公司购买联系方式 广州市瑞品生物技术有限公司（020）89883786手机Q 1851480094产品简介 RIDASCREENFAST Vitamin B12维生素B12快速检测试剂盒，采用竞争性酶联免疫法，定量检测含维生素的食品、饲料和维生素产品中的维生素B12。 试剂盒中含有酶联免疫检测所需的所有试剂，包括标准品。 试剂盒足够进行48次检测（包括标准测定）。 定量分析需要使用微孔板酶标仪。 样品处理： 奶类样品：离心和稀释 果汁样品：稀释、过滤或离心 其他样品：均质、提取、过滤或离心和稀释 检测时间： 样品制备（以10个样品为例）. 约30 - 60分钟 检测过程（孵育时间）.25分钟 检测限： 原奶样品. 约0.5 ppb 巴氏灭菌后鲜奶样品.约2.5 ppb 奶类混合饮料 . 约2.5 ppb 奶粉样品.约10.0 ppb 谷物，面粉，谷类食品. 约25.0 ppb 维生素粉剂，-预混合料，-片，-胶囊和-糖果. . 约25.0 ppb 富维生素果汁 . 约2.5 ppb 特异性： RIDASCREENFAST Vitamin B12维生素B12快速检测试剂盒的特异性通过和相应的维生素的交叉反应确定。 维生素B12 . 100 % 维生素B12a（羟钴胺素） .约80 % 1. 用途 RIDASCREENFAST Vitamin B12维生素B12快速检测试剂盒，采用竞争性酶联免疫法，定量检测含维生素的食品、饲料和维生素产品中的维生素B12。 2. 概要 维生素B12是脊椎动物新陈代谢中的重要辅酶之一，具有合成血红细胞，代谢脂肪酸和可转化为叶酸等重要功能。叶酸本身就在核苷的生物合成和氨基酸周转方便扮演举足轻重的角色。缺乏维生素B12可导致恶性贫血甚至神经系统并发症。 3. 检测原理 微孔板中包被有针对维生素B12的特异性抗体。加入维生素B12标准品、样品及酶标记的维生素B12（酶连接物）。游离的和酶标记的维生素B12竞争结合维生素B12抗体结合位点（竞争性酶联免疫法）。没有结合的酶标记的维生素B12在随后的洗涤步骤中被除去。在孔中加入底物/发色剂，结合的酶连接物将发色剂转化为蓝色。加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色。在 450 nm处测量，吸光度值与样品中的维生素B12浓度成反比。4. 试剂盒组份 每一个盒中的试剂足够进行 48个试验（包括标准测定），盒中的组份如下： 1 x 48孔微孔板（6条每条8孔） 包被有维生素B12抗体 6 x 标准品浓缩液（每瓶1.3 ml） 0 ppb （零标准品），5 ppb，10 ppb，30 ppb，100 ppb，300 ppb 维生素B12水溶液 1 x 酶连接物（0.7 ml） .红色瓶盖 过氧化物酶标记的维生素B12 浓缩液 1 x 底物/发色剂（10 ml）.棕色瓶盖 红色，含过氧化脲 1 x 反应终止液（14 ml）.黄色瓶盖 含1 N的硫酸 1 x 缓冲液盐（洗涤缓冲液） 用于制备 10 mM磷酸缓冲液（pH 7.4） 含0.05 % Tween 20 1 x 缓冲液1（50 ml） 标准品、酶连接物和样品稀释缓冲液1 x 缓冲液2（10 ml） 用于奶类样品的标准稀释缓冲液5. 另需的试剂和设备 5.1. 设备： 微孔板酶标仪（450 nm） 粉碎器 离心机 + 离心管 振荡器 水浴锅（100 C） 折叠滤纸和漏斗 刻度移液管 可调式20 l - 200 l 和200 - 1000 l 微量移液器 5.2. 试剂： 抗坏血酸氧化酶条（罗氏诊断试剂，订货号：10736619001）针对高维生素 C 含量的样品（ 10 g/g） PBS缓冲液，pH 6.0：0.55 g NaH2PO4 x H2O + 2.85 g Na2HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl加入蒸馏水至1000 ml，用 5 N的 HCl调节pH值至6.0 （此缓冲液可在2 - 8C条件下可保存4 - 6周） 样品稀释缓冲液，PBS-Tween缓冲液，pH 7.2：0.55 g NaH2PO4 x H2O + 2.85 g Na2HPO4 x 2 H2O + 9 g NaCl + 1 ml Tween 20加入蒸馏水至1000 ml（此缓冲液可在2 - 8C条件下可保存 4 - 6周） 脱脂奶粉（食品级）6. 操作者应该注意之事项 反应终止液含1 N硫酸（R36/38， S2-26）。 7. 储存条件 保存试剂盒于 2 - 8 C，不要冷冻。 将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封储存于 2 - 8C条件下。 底物/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 对过了有效期（见试剂盒外标签有效期）的试剂盒不再提供任何质量保证。 不能交叉使用不同批号的盒中试剂。 8. 试剂变质的迹象 红色底物/发色剂在使用前颜色变蓝 零标准品的吸光度值小于0.6 （E450 nm 10 g/g或10 g/ml）有必要使用抗坏血酸氧化酶条（参见5.2）孵育。然后样品溶于（不是蒸馏水）PBS缓冲液中，pH 6.0（参见5.2.） 在加热和离心后加入一抗坏血酸氧化酶条于上清液中，在室温下（20 - 25 C）孵育15分钟，不时振荡。 去除抗坏血酸氧化酶条，上清液按比例1:5（1+4）用样品稀释缓冲液稀释 每孔取50 l进行检测 9.4. 富维生素果汁 1 ml果汁用4 ml样品稀释缓冲液稀释 样品用滤纸过滤或离心 如必要，用抗坏血酸氧化酶条孵育（参见9.3.） 每孔取50 l滤液或上清液进行检测 备注： 如果粉剂、胶囊、片剂或果汁中的维生素B12浓度预计大于 800 ng/g ，按上面步骤得到的样品液应继续相应进行稀释。 样品制备原则（9.2.和 9.3.）： 如果回收率过低，建议使用50 %甲醇溶液（50 ml 甲醇（100 %）和 50 ml蒸馏水混合）代替水进行样品提取。对甲醇提取物过滤或离心，在进行相应稀释后可用于检测。10. 检测步骤 10.1. 检测前的准备 使用之前将所有试剂回温至室温（20 - 25 C）。 维生素B12酶连接物（红色瓶盖瓶子）为浓缩液。由于稀释的酶连接物的弱稳定性，所以只稀释实际需用量的酶连接物。在吸取浓缩液之前，要轻轻的振摇以便充分混均。用缓冲液以 1:11（1+10）的比例稀释酶连接物浓缩液（例如：200 l浓缩液 + 2.0 ml缓冲液，足够4个微孔板条用）。 标准品为浓缩液。用缓冲液按比例 1:10（1+9）稀释标准品浓缩液，即每 50 l 标准品浓缩液用450 l缓冲液稀释混合。 在进行奶类样品检测时使用缓冲液 2。针对样品制备（9.1.） 混合于脱脂奶粉中的标准品的制备：如奶粉包装上没有特别说明，取 1 g 脱脂奶粉溶于10 ml蒸馏水中，然后按以下比例用缓冲液进行稀释。 标准品1： 50 l标准品浓缩液1 + 450 l缓冲液 0 ppb 标准品2： 50 l标准品浓缩液2 + 450 l缓冲液 0.5 ppb 标准品3： 50 l标准品浓缩液3 + 450 l缓冲液 1 ppb 标准品4： 50 l标准品浓缩液4 + 450 l缓冲液 3 ppb 标准品5： 50 l标准品浓缩液5 + 450 l缓冲液 10 ppb 标准品6： 50 l标准品浓缩液6 + 450 l缓冲液 30 ppb 洗涤缓冲液是 PBS-Tween 缓冲液，为此试剂盒中提供了一袋洗涤缓冲液盐（参见4.）。使用 1 l 蒸馏水溶解一袋洗涤缓冲液盐制得缓冲液。制备好的缓冲液可在 2 - 8 C下保存大约4 - 6 周时间。 或者： 用 100 ml 蒸馏水溶解袋中的洗涤缓冲液盐，得到 10 倍的洗涤缓冲液盐浓缩液，此溶液能在室温（20 - 25 C）下储存 8 - 12 周。 使用时，用9 份蒸馏水溶解 1 份此浓缩液得到洗涤缓冲液。10.2. 检测操作 1. 将足够标准品和样品检测所需数量的孔条插入微孔板架，记录下标准品和样品的位置。 2. 将 50 l 标准品及处理好的样品溶液加到相应的微孔中；移取标准品或样品时使用新的移液管枪头。 3. 向每一个微孔中加入 50 l 稀释后的酶连接物溶液（红色瓶盖），小心混匀，在室温条件下（20 - 25 C）继续孵育15分钟（+/-1）。 4. 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3 次）以保证完全除去孔中的液体。使用多级移液器向每孔加入 250 l 洗涤缓冲液（参见10.1.）洗涤微孔，完全除去孔中的液体。上述操作再重复进行两遍。 5. 向每一个微孔中加入 100 l 底物/发色剂（棕色瓶盖），充分混合后在室温（20 - 25 C）条件下暗处孵育 10 分钟（+/- 0.5）。 6. 向每一个微孔中加入 100 l 反应终止液（黄色瓶盖），充分混合。在加入反应终止液后10 分钟内于450 nm 处测量吸光度值。 11. 结果评估 请使用R-Biopharm德国拜发公司专门为RIDASCREEN 系列产品设计的应用软件RIDA SOFT Win（订货号：Z9999）来进行结果分析。 关于标准曲线请参看试剂盒中附带的质保证书。 以下是没有使用软件的计算方法： 标准品的吸光度值（或样品） - x