ELISA常见问题及处理对策

ELISA 常见问题及处理对策常见问题及处理对策 问 题 可能原因解决方法 无 颜 色 试剂孵育的时间没有按说明书操作 不同试剂盒或不同批号的试剂混用 漏加酶 HRP 酶污染了叠氮钠 标准品有问题 若在标本孔中有信号 某一容器未洗净 残留灭活酶物质 使用含血清的缓冲液配制 复溶抗体 漏加显色剂 A 或 B 试剂配制 使用有误 缓冲液污染 确定生物素化抗体 连接的 HRP 试剂或链霉亲和素 HRP 使用的时间是否适当 重新检查试剂的标签 确准所有组分都属于正使用的试 剂盒中的 不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂 检查操作流程 注意不要漏加 使用新配制的试剂 禁含叠氮钠 按说明书检查标准品的制备使用 1 瓶新标准品 尽可能用试剂盒内容器 另觅一定要洁净 可靠 重新确认所选用的试剂 加显色剂后观察一下液面高度 将实验重做 严格按说明书操作 每次配制和使用前看 清标签 配制新新鲜的缓冲液 问 题 可能原因解决方法 显 色 弱 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号 加入试剂的体积和时间有误 试剂 样品用前未能平衡 缩短孵育时间能使实验的信号变弱 在温度变化的环境内孵育酶标板 使用了被污染的试剂 标准品 标本制备方法不规范 显色底物制备不规范 检测时间不当 仪器设定不正确 滤光片不匹配 检查产品的有效期 确定所使用的每一个试剂的体积正确的和 加入的时间是适当的 用前试剂 样品置室温平衡 10 分钟左右 检查孵育的时间 确定孵育的温度 应避免温度的变化 检查试剂是否被污染 检查标准品 标本的制备 标准品应按说明 书进行复溶和稀释 低温贮存的标本避免 反复冻融 严禁使用溶血标本 样品用 NaN3 防腐 抑制了酶的反应 检查底物的制备 如体积是否正确 混合 是否恰当充分 是否在规定的时间内检测 仪器是否设定正确 滤光片的使用等 高背 景 本 洗涤操作不规范 实验中孵育温度和时间 洗板不充分 使用手工洗板常出现 最好使用洗板机 或使用洗瓶洗涤 每孔应完全充满洗涤缓冲液 倾出时应迅速 若使用洗板机 应校准并 设定足够充满每孔的体积量 板的内侧不应接触设备 检查每孔是否有 底 不适当 酶加量过多 封闭不完全 标本或标准品中的干扰 物质 显色剂受光照时间较长 或污染 整批样品放置时间过长 样品污染 缓冲液污染 吸头重复使用 未洗净或 消毒不完全而用于加酶 或显色剂 残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确 在两次洗板之间加 30 秒的浸 泡 确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当 加酶前验看移液器调节量是否准确 检查稀释度 若必要进行效价测定 检查封闭液的计算量 提高封闭时间 做适当的对照 显色剂 A 和 B 应于使用前 10 分钟从冰箱取出 样品应保持新鲜 或低温保存 防止污染 制备新鲜的缓冲液 吸头尽可能一次性使用 太多 的信 号 全部 的板 子变 成规 则的 蓝色 试剂孵育的时间没有按说明书操作 不同试剂盒或不同批号的试剂混用 漏加酶 HRP 酶污染了叠氮钠 标准品有问题 若在标本孔中有信号 某一容器未洗净 残留灭活酶物质 使用含血清的缓冲液配制 复溶抗体 漏加显色剂 A 或 B 试剂配制 使用有误 缓冲液污染 确定生物素化抗体 连接的 HRP 试剂或链霉亲和素 HRP 使用的时间是否适当 重新检查试剂的标签 确准所有组分都属于正使用的 试剂盒中的 不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂 检查操作流程 注意不要漏加 使用新配制的试剂 禁含叠氮钠 按说明书检查标准品的制备使用 1 瓶新标准品 尽可能用试剂盒内容器 另觅一定要洁净 可靠 重新确认所选用的试剂 加显色剂后观察一下液面高度 将实验重做 严格按说明书操作 每次配制和使用前 看清标签 配制新新鲜的缓冲液 问题可能原因解决方法 高 CV 值 CV coeffic ient of variation 花板 操作不慎或洗涤不充分 出现干板 没有使用封板膜 封板膜重复使 用 由于操作失误或板子质量差 结合不均匀 造成包板不均匀 移液器不准确 吸头重复使用 样品离心处理不全 反应孔内发生凝血或残留 细胞成分 按说明书洗板 加样 显色 洗板尤为重要 如上所述 确定每两步骤间 酶标板应保持湿润 使用 封板膜封口 注意每步使用新鲜的封板膜 稀释用的 PBS 中不要加其它蛋白检查包被和 封闭液体积 时间和试剂加入的方法 检查 所使用的酶标板 使用 ELISA 板子 不要使 用组织培养板 检查并校准移液器 每次取样必须换吸头 缓冲液污染 回顾标本的加入步骤 确保每次加样的准确 性 保证吸取的液体按所设定的体积吸入和 排出 连续加样时注意检查吸头 确保所加 液体的体积 标本充分离心 3000rpm 6 分以上 严禁使 用凝血 溶血 的标本 制备新鲜的缓冲液 问题可能原因解决方法 标准曲线可得 到 但两点之 间区别很差 低或平的曲 线 酶结合物不足 捕获抗体没有很好结合到板上 检测抗体不足 板子显色不足 操作不慎 标准曲线稀释度计算有误 检查稀释度 必要 时进行效价测定 检查所使用的酶标 板 使用 ELISA 板 子 不要使用组织 培养板 稀释用的 PBS 中不要加其它 蛋白 检查稀释度 必要 时进行效价测定 延长底物孵育实验 使用推荐品牌的底 物溶液 回顾 ELISA 操作流 程 消除任何擅自 修改的程序 核查计算的情况 制备新的标准曲线 标准曲线很好 但是没有任何期 望的阳性信号产 生 在标本中无相 应的细胞因子 标本基质遮盖 检测 使用内参对照重复实验 重新考虑实验的相应参数 将标本至少做 1 2 相应的稀释 或进行系列稀释观测它的恢复性 标准曲线很好 但是标本的判 读值很高 当使用 HRP 酶结合物时 TMB 底物加终止液后显绿色 边缘效应 标本中含的细胞因子水平超过实验 范围 孔中的试剂显色不充分 工作环境温度不均衡 将标本做稀释并再次实验 轻轻振荡板子 避免将板子在变化温度环境中孵 育 漂移 实验过程中出 现间断 试剂没有按说 明书平衡至室 温 整个实验应连续操作 在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准 备 在所有试剂加入孔前 确保它们已平衡至室温 除非说明书中有另外 的要求 是否可更改试剂盒 所提供的 实验操作步骤 是否可混用不同试剂盒中的 试剂 是否可增加或减少标本的体 积 是否可重确定自己的标准曲 线的点 一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性 对试剂 盒都进行了优化 为确保每一试剂盒实验的规范 性应按说明书操作 不行 绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异