【毕业学位论文】（Word原稿）海岛棉NPR1和XET基因的克隆及表达生物化学与分子生物学博士论文

密级：（内部 5 年） 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 海岛棉 因的克隆及表达 ii 缩略词表 缩写 英文名称 中文名称 杨酸 ,6， 6,2,3)并噻唑类制剂 统获得性抗性 导系统抗性 JA 莉酮酸 烯 R XG 葡聚糖 葡聚糖内转糖苷酶 要 棉花是一种重要的经济作物，在国民经济中具有重要作用。当前我国棉花生产中存在两个关键问题：一是黄萎病危害严重，缺乏抗黄萎病的棉花品种；二是纤维品质中等和单一，在国际市场上缺乏竞争力。针对以上问题，本论文进行了以下两方面的研究。 1. 海岛棉系统获得性抗性（ 径中调控基因 克隆及表达 R 是 径中的中心元件，其功能定位在水杨酸（ 累之后、 因表达之前。本研究利用拟南芥 核苷酸序列 物，发现了两处保守区，根据此保守区序列设计简并引物，克隆得到了海岛棉 基因片段；然后用 3 of 和 5术，克隆了 全长 列。分析发现， 起始密码子上游存在 2 个 W 框；推导的氨基酸序列与已知 同源性较低 （ 39 55%），但在功能区的同源性可达 70以上； 明该蛋白中含有 锚蛋白重复序列结构域。在拟南芥中， 始密码子上游有 3 个 W 框，对诱导 表达和激活 导的植物防卫反应至关重要，锚蛋白重复序列则是 现其功能必不可少的。由此可以断定我们克隆的基因是 海岛棉中的同源基因，命名为 构建了正义、反义和 物表达载体，利用花粉管通道法将这三种质粒转入棉花，同时将正义（ 反义（ 物表达载体通过农杆菌介导法转入了烟草，均获得了转基因植株。通过 交技术检测 ，结果表明目的基因已整合到烟草和棉花基因组中。用离体叶片接种法对转基因烟草进行抗病性鉴定，有 5 株转 烟草对赤星病菌的抗性明显提高。 2. 海岛棉 因的克隆及过量表达对酵母细胞伸长的影响 木葡聚糖内转糖苷酶（ 一类重要的细胞壁松弛酶，与细胞的伸长密切相关。本研究以海岛棉 7124 为材料，用 术得到了海岛棉的 全长 因 基酸同源性比较表明， 已报道的其他植物的 白 有较高的同源性（ 67 71%），且含有 活性催化位点 构建了酵母表达载体，利用裂殖酵母表达系统对该基因的功能进行了活体分析， 裂殖酵母中的过量表达 促使 细胞伸长约 1 倍，且细胞为单核，暗示 细胞伸长的促进作用是由于细胞壁的松弛而引起的。这是首次通过转基因技术在活体条件下证明 有促进细胞伸长的功能。 构建纤维特异表达启动子 动的 物表达载体和 物表达载体，用花粉管通道法转化棉花，获得转基因植株，其对纤维品质的影响正在研究中。 关键词： 海岛棉 克隆 表达 v as of an in in is of to of in as 1. AR is a at a A AR of we . 7124 as a to by W- in TG of to a at TB is by 5S of of in by 2. of on in is a of It is a ET G. we . 7124 as a to CR is to ET 67% 71%) to in In vi as of To of is to ET is to in in by ; R 录 引言 1 第一部分 海岛棉系统获得性抗性途径中调控基因 克隆及其在转基因烟草中的表达 2 第一章 文献综述 2 1. 植物 R 基因与病原物 因的互作 2 原物 因 2 物 R 基因 4 R 蛋白的互作 6 2. 植物抗病信号传递 6 物抗病途径 7 物防卫反应信号传递相关基因 11 3. 植物防卫反应基因 16 丁质酶和 16 R 蛋白 17 它的防卫基因 18 4. 研究的目的意义 19 第二章 试验研究 20 第一节 海岛棉系统抗性途径中调控基因 克隆及序列分析 20 1. 材料与方法 20 料 20 法 21 2. 结果与分析 28 岛棉 长 克隆 28 列分析 31 3. 讨论 35 第二节 转 因烟草的抗病性分析 37 1. 材料与方法 37 1 料 37 法 38 2. 结果与分析 46 物表达载体的构建 46 物表达载体的构建 49 草的遗传转化及再生植株的分子检测 52 基因烟草的抗病性分析 53 花的遗传转化与筛选 54 3. 讨论 54 参考文献 56 小结 69 第二部分 海岛棉 因的克隆与功能分析 70 第一章 文献综述 70 1. 棉花纤维的发育 70 2. 细胞壁结构与细胞伸长、纤维发育 70 展蛋白 72 葡聚糖内转糖苷酶 74 3. 本研究的目的意义 76 第二章 试验研究 77 1. 材料与方法 77 料 77 法 78 2. 结果与分析 92 因全长 克隆 92 因序列分析 93 因酵母表达载体的构建 95 因在酵母细胞中的过量表达对细胞长度的影响 96 物表达载体的构建 97 花的遗传转化 98 3. 讨论 101 参考文献 103 小结 110 结论及创新点 111 致谢 112 作者简介 113 1 引言 棉花是一种优良的天然纤维，具有吸湿、 通气、保暖性好、不带静电、手感柔软等人造纤维难以取代的特点。九十年代以来，随着人们保健意识的增强和生活水平的提高，穿着天然纤维的服装已成为一种不可逆 转的国际潮流。 我国是当今世界 5 大产棉国之一，棉花的单产、总产水平和栽培面积均处世界前列。但目前我国棉花生产上存在两个关键性难题：一是棉花纤维品质中等，且品质单一，在国际市场中缺乏竞争力，长绒纤维主要靠进口；二是黄萎病危害严重。自 90 年代以来，黄萎病的发生有加重趋势，发生范围也日趋扩大，造成巨大经济损失。 植物基因工程的发展为棉花抗病育种和纤维品质改良提供了新途径。目前，开展棉花基因工程已具备了优越的条件：（ 1）转基因技术如花粉管通道法和农杆菌介导法已成功地用于棉花的遗传转化，花粉管通道法不受基因型的限制； （ 2）转基因抗虫棉已在生产上大规模应用，积累了丰富的经验；（ 3）在模式植物中已克隆了许多与抗病和细胞发育相关的基因，可以用分子生物学的方法去发掘棉花中的同源基因（ （ 4）棉纤维主要用作工业和成衣原料，转基因产品的安全性问题较食用作物要小。但由于棉花基因组较大，结构基因组的研究落后于拟南芥和水稻，已克隆的有重要应用前景的基因贫乏，且对抗黄萎病和棉纤维发育的分子机理认识匮乏，因此，上游工作的薄弱仍然是通过基因工程手段改良棉花的瓶颈所在。 随着分子生物学技术的发展，新的技术平台不断建立， 术是一种克隆基因的有效方法，省去构建 库的繁琐工作， 术则可诱导基因沉默来鉴定基因的功能。利用生物信息学和很多生物网站的信息数据，可为同源基因的克隆提供基础。 海岛棉是棉花四个栽培种之一，高抗黄萎病，纤维品质优良。本研究以海岛棉为材料，通过术克隆了系统获得性抗病途径中的主要调控基因 细胞壁修饰酶基因 对其功能进行了初步研究，期望为棉花基因工程提供有用的基因资源。 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 2 第一部分 海岛棉系统获得性抗性途径中调控基因 克隆及表达 第一章 文献综述 植物在与 微生物长期共同进化的过程中，形成了一系列防护机制来抵抗病原菌的侵染。早在20 世纪 60 年代，美国植物病理学家弗洛尔（ 1971）提出了基因对基因的假说，引导人们对植物抗病机制的研究逐步进入分子水平。半个多世纪的研究积累了丰富的资料，为揭示植物抗病机理奠定了坚实的基础。 在不亲和互作模式中，植物经病原菌侵染后，首先通过信号识别，即病原菌的无毒基因 之间相互作用，产生激发子，激活植物体内的防卫反应，一系列抗病信号传导相关基因表达，最后是防卫基因表达，使植物表现出抗病性。对 R 和 间的互作 及信号传导相关基因的研究，将为植物抗病基因工程的发展提供理论依据。 1. 植物 R 基因与病原物 因的互作 1971）的基因对基因假说认为，如果寄主中有一个调节抗病性的基因，病菌中就有一个相应的基因调节致病性，其中寄主的抗病基因（ R）和病菌的无毒基因（ 显性的，而寄主的感病基因和病菌的毒性基因是隐性的，只有具有抗病基因的植物品种和具有无毒基因的病菌小种互作时才表现抗病，其它情况均表现感病。目前已克隆了多个 R 基因和 因，分析已知病原物无毒因子与植物 R 基因的特性及功能，将有助于加 深了解植物的抗病机理。 原菌的无毒基因 初是根据在含有 R 基因的寄主植物中诱导抗病性的能力来定义的，是指与寄主 R 互作、产物与寄主 R 基因产物互补、 对寄主植物特异性不亲和的基因，也称为寄主专化性基因或反向调节寄主范围的基因 ( 1990)。基因对基因假说的经典解释是受体 般认为，无毒基因编码的特异性激发子为配体， R 基因产物为受体 ( 1990)， 激发子与相应的 R 基因产物识别诱导寄主的防卫反应，从而表现小种品种互作的不亲和性。无毒基因 失活或缺乏相应的无毒基因，则表现为小种品种互作的亲和性反应，植物表现为感病。 迄今已从植物病原物（包括真菌、细菌、病毒等）中分离获得多种无毒基因。 菌的 因 目前已克隆了约 40 多种细菌的 因，主要来自假单胞属 黄单胞属 2000）。它 们位于染色体或质粒上，编码亲水性可溶蛋白，且不具有典型的信号肽。尽管已分离到很多细菌的无毒基因，但除 ) 家族外，大部分没有或只有很少的同源性。 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 3 因家族 因 家 族 分 布 于 此基因家族成员有以下共同特点： 1）可以在抗性寄主上引起过敏性反应（ 2）在感病寄主上加重病症； 3）序列同源性很高。 族成员在结构上的典型特征是 在其中心区域都含有一个 34 个氨基酸串连的重复区域， C 端含有 核定位序列（ 和酸性的转录激活结构域（ 基因家族成员间的不同在于重复序列数目的不同（ ） ( 2001)。重复序列对诱发多数寄主植物的 决定作用， 是激发植物 必需的 (， 1996； ， 2000)， 类 白中的 变将失去识别相关 R 蛋白的功能 ( 2001)。 族 族中最先分离到的成员是源自植物病原物 源自 2001），该家族还包括哺乳动物病原菌 Y. ， 1997)、植物病原菌 X. (， 1999)、 (， 2000)、 (， 2000)、 (， 2001) 以及植物共生菌 (， 1997)。 序列间没有显著同源性的无毒基因主要克隆自 包括一些克隆自无毒基因，编码小型亲水性蛋白，分子量多数在 18 40 有个别产物的分子量高达 100 1987)。 毒的 因 植物病毒的无毒基因编码病毒的重要组分，如：病毒衣壳蛋白、复制酶蛋白和运动蛋白等。 研究发现一种病毒可诱发多种植物产生 种病毒无毒因子可以诱导不同 R 基因介导的胡椒轻型斑驳病毒的外壳蛋白可诱导胡椒 R 基因 导的 清 学上相关性小的不同病毒的外壳蛋白可诱发同一 R 基因介导的 ：烟草花叶病毒（ 黄瓜斑驳花叶病毒（ 外壳蛋白均可诱导毛叶烟（ N介导的 1997） 。从寄主角度讲，不同植物中不同 R 基因，可以分别识别同种病毒中不同的无毒因子，如烟草 N 基因、毛叶烟 (N. N 基因、番茄 2 基因能够分别识别 复制酶 ( ， 1999)、外壳蛋白 (， 1991) 及运动蛋白 (， 1993)，从而表现 病毒无毒因子与互补的 R 基因产物也可能通过间接的相互作用导致 抗病反应。 用芫箐皱缩病毒（ 的 子外壳蛋白 (对拟南芥基因文库进行酵母双杂交检测，没有筛选到对 生 R 基因，却发现一种可能是 发子胞内受中国农业科学院博士学位论文 文献综述 4 体的寄主蛋白 （ ， 2000），这说明 R 可能是以间接作用的方式与 P 相互作用 (， 1998； 2001)。 菌的 因 由于缺乏简便有效的克隆方法，迄今只是通过反向遗传法从为数不多的几种真菌中克隆到了一些无毒基因 。 番茄叶霉菌 (的 因是最早被克隆的真菌无毒基因，编码小分子量的胞外蛋白，均含偶数半胱氨酸，在维持蛋白识别结构或直接在蛋白与抗病基因产物的识别中起重要作用 ( , 1997)。 在稻瘟菌 （ 中克隆得到两类无毒基因。第一类编码品种特异性抗性激发子，迄今唯一克隆的成员是一个 编码 中性锌金属蛋白酶的 基因 ， 2000)。第二类无毒基因编码非品种特异性抗性激发子，包括 码产物包括信号肽共 145 个氨基酸，是一种小型富含甘氨酸的疏水蛋白 ( , 1995)。 从大麦云纹病菌 (分离鉴定的一种无毒基因，可以诱导多种禾本科作物产生坏死反应，还 可高度特异性地在含抗病基因 品种中诱发过氧化物酶基因及病程相关蛋白基因 的表达 ( , 1995)，由此推断 与大麦 补的无毒基因。 其它真菌的无毒基因的克隆也在进行中。包括编码豇豆锈病 种特异性激发子的基因，亚麻锈菌 无毒基因，十字花科黑胫菌 无毒基因 及 无毒基因 ( 1998； ， 2000)。 毒基因在病原物致病性中的作用 无毒基因是病原物的遗传因子，它可以使相应的寄主植物对病原物的侵染产生防卫反应，这显然不利于病原物的生存和发展。为什么病原物产生一种限制自身的信号，并且在与植物抗病基因一起漫长的进化过程中没有消失？研究表明，无毒基因具有有利于病原物自身生存的功能。真菌 一种无毒基因，该基因的突变株 在番茄叶片中的菌丝生长和分生孢子形成均明显不如野生型 ( ,1997)。对大量病原物突变体的 分析结果也表明，在寄主不含相关 R 基因时， 因可对病原物提供一种选择优势 ( ， 2000； 2001； ， 2000)。 同时应当指出，毒性和无毒基因只是人为的命名。无毒基因具有双重功能：在含互补抗病基因的植物中表现无毒效应，而在不含互补抗病基因的植物中则显示小种、菌株、致病型、或种特异性的毒性效应。在细菌无毒基因中，至少有十几个基因在一种或多种细菌菌 株、致病型或种中，对不含互补抗病基因的寄主植物表现致病性和毒性作用 ( , 2000； , 2000)。多数病原菌无毒基因在病程中的作用尚有待进一步研究。 物的 R 基因 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 5 基因的分类 病原细菌在植物体内的特异性识别常常是由单个抗病基因 R 控制。抗病基因是指基因对基因假说中寄主植物与病原无毒基因表现非亲和互作的基因，它决定寄主植物对病原菌的专化性识别并激发抗病反应。 1992年， 用转座子标记技术克隆了第一个植物抗病基因玉米的抗 圆斑病基因 1993年克隆了番茄的 因。此后 R 基因的研究取得了重大进展 ( , 1996； , 2000； 2001)。迄今已经克隆了 40 多个 R 基因 （ 2003）。 大多数 R 蛋白具有胞间或胞内亮氨酸重复序列 (结构域 ( , 2001； 2001)。 根据蛋白的结构特征， R 基因编码的蛋白可分为 5大类：细胞内的蛋白激酶、具有胞外 构的类似受体的蛋白激酶、具有细胞内 R 基因、编码与细胞膜结合的细胞外 白和毒素还原酶。 具有细胞内 R 基因是最大的一类 R 基因。 显著的结构特点是有一个数目可变的 C 端 经在多种不同的蛋白中发现 构域，它是蛋白与蛋白作用、多肽与配基结合、蛋白与碳水化合物结合的功能位点 ( 1997； 1998)；此外，每一个 R 蛋白都包含一个保守的 点，这一位点在其他蛋白中对 结合很重要 ( , 1990)。 蛋白根据 N 端结构特点可分为两类 : 一类具有与果蝇胞内信号结构域和哺乳动物白介素 体同源的结构域 (目前仅在双子叶植物中发现了这类基因，包括拟南芥的 草的 N、亚麻的 基因；另一类包含螺旋 ( ( , 2001； , 2000； , 2001)，由于螺旋 可分为多个亚家族。 蛋白的结构与功能的关系 R 蛋白有两种功能：（ 1）病原物识别；（ 2）信号传导，启动植物的防卫反应。 R 蛋白有一个调节结构来确保它们在信号感应转导过程中的功能 。 水稻的 因和拟南芥编码油菜素类固醇受体的 () 基因产物都包含一个 激酶结构域。将 白与 白的结构域部分互换，杂合蛋白中含 有 和 激酶区，在油菜素类固醇的作用下，杂合蛋白质可激活防卫反应（ ， 2000），表明