【毕业学位论文】（Word原稿）两个受水稻白叶枯病菌调控的水稻基因植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 两个受水稻白叶枯病菌调控的水稻基因( 鉴定和 功能 初探 of of I 摘 要 阐明水稻 白叶枯病菌 (简称 和 性 互作中水稻重要基因的功能 ， 对于深入了解水稻抗 /感病机制 ， 探索更为科学有效的防治方法具有重要的意义。在前期工作中 ， 本实验室 用 析 了 水稻 品种日本晴 悬浮细胞与 互作时 的基因表达谱，筛选到了一批在互作中差异表达的基因 ； 其中 用 实时定量 分析 水稻 的 感病 互作 ， 验证了这两个基因表达 同样 显著地受 本研究 对 并为 进一步分析 它们的 功能奠定基础 。 根据 列， 设计 和 合成了特异性引物，通过 目的片段克隆到 进行 序 列 测定 。通过比对发现克隆的 目的基因 序列 与 物信息学分析表明， 号染色体上，具有 5个外显子和 4个内含子， 成熟 28核苷酸 ；可编码具有 175个氨基酸的蛋白质，具有 ；推测 它 可能与淋巴细胞中 与了新生多肽的折叠 。号染色体上，具有 6个外显子和 5个内含子，成熟 140核苷酸 ；可编码具有 424个氨基酸的蛋白质，具有 2守结构域，推测该蛋白可能为 C结合蛋白 A。 将 到 其转化到大肠杆菌表达菌株 E3)入 验获得了一条与预 测分子量大小相当的明显条带。 用 行 了 究 。 将 5建了含有 5基因枪转化方法转化洋葱表皮 细胞，用激光共聚焦显微镜观察融合基因的瞬时表达，发现 要在 细胞核内表达。 分 别 用 含 因 过 量 表 达 载 体 扰 载 体稻品种日本 晴 愈伤组织 ， 经潮 霉 素 抗性 筛选、分化等过程 ， 分别 获 得 了 将 隆 到 构建了用于 用农杆菌介导的转化方法，转化水稻品种日本晴愈伤组织，得到了抗潮霉素抗性转化苗。 检测 表明 ， 试验获 得了 关键词 ： 水稻 ； 白叶枯病菌 ； 功能 分析 of of in is of to of In to of 1 to or in 21 to We CR to of In we to of NA by to of 00% in 28nt a 175 aa a it as is in 140a 424 aa a 2it is a of FP 5by 5by to of in to A by to to 0 CR US 录 第一章 文献综述 . 1 物与病原菌互作分子机制的研究进展 1 因对基因学说 1 发子 /受体模型 1 卫模型 1 物抗病基因 1 稻与白叶枯病菌互作的分子机制 3 稻白叶枯病 3 稻白叶枯病菌无毒基因研究概况 3 稻抗白叶枯病基因研究进展 3 稻感病基因研究 5 因功能分析策略 5 物信息学 5 因陷阱 6 于突变的基因功能 分析技术 6 白质组学研究 6 因沉默技术 7 因功能研究的重要方法 扰技术 7 扰技术发展历程 7 扰的机制 7 制的模型 8 用 术研究水稻基因功能研究 9 究水稻基因功能的关键技术 9 稻遗传转化的 受体 9 稻遗传转化的方法 9 研究的目的意义和研究内容 10 究目的和意义 10 要研究内容 10 术路线 11 第二章 目的基因 隆、测序及生物信息学分析 . 12 料和方法 12 稻总 提取 12 成 13 的基因的扩增 14 的基因 隆 16 的基因序列分析 19 码蛋白同源性比对及蛋白结构分析 19 果与分析 19 的基因 克隆 19 因序列分析 22 码蛋白质预测与分析 23 章小结与讨论 26 第三章 原核表达及亚细胞定位 . 27 料与方法 27 原核表达 27 亚细胞定位 29 果与分析 33 原核表达 33 亚细胞定位 34 章小结与讨论 36 第四章 因过量表达和 性植株的获得 . 38 料与方法 38 杆菌的转化 38 养基的准备 39 伤组织的转 化及抗性苗的再生 40 果与分析 41 杆菌的转化 41 伤组织的诱导、转化及再生 42 章小结与讨论 44 第五 章 因 元表达载体的构建 和 基因植株的获得 . 46 料与方法 46 元表达载体的构建 46 杆菌转化 48 伤组织的诱导、转化及再生 48 基因苗 检测 48 V 基因苗的 色 49 果与分析 50 元表达载体 构建 50 基因苗的获得 51 基因苗的检测 52 章小结与讨论 53 第六章 全文结论 . 55 文结论 55 参考文献 . 56 致 谢 . 62 附录 . 63 作 者 简 历 . 66 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 2, 4,4, 4AS 酰丁香酮 6bp 基对 5S 椰菜花叶病毒 35S 启 动子 补 氧核糖核苷 三磷酸 二胺四乙酸 霉素 使 S S 培养基 6 56 大量 量培养基 乙酸 脂碱合成酶基因 合酶链式反应 分钟转数 二烷基苯磺酸钠 移 羟甲基氨基甲烷 碳酸二乙酯 EB 化乙锭 OD 密度 酸 酶 落酸 甲基乙二胺 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 1 第一章 文献综述 物与病原菌互作 分子机制的研究进展 因对基因学说 具有小种专化性抗病性的寄主植物与其病原物之间具有复杂的相互作用。 1956年 亚麻锈病的 病理学 ,提出 了 “基因对基因学说 ”（ ,阐明了这类相互作用的遗传学特点 （ 956） 。 其基本内容是：病原体与寄主的关系分亲和与不亲和两种类型，亲和与不亲和病原体分别含毒性基因 (无毒基因 (亲和与不亲和寄主分别含感病基因 (r)和抗病基因 (R)。当携 有 因的病原体与携 R 基因的寄主互作时，二者表现不亲和，即寄主表现抗病性；其他 3种组合则表现为亲和，即寄主感病。这一假说构成了 克隆病原体无毒基因和植物抗病基因的理论基础。 它 不仅可用以 改进品种抗病基 因型与病原物致病性基因型的鉴定方法，预测病原物新小种的出现，而 且 对于抗病性机制和植物与病原物 协同 进化理论的研究也 具 有指导作用。 发子 /受体模型 (激发子 /受体模型是对基因对基因假说从生物化学角度的阐释。该模型认为：病原体的 无毒基因 直接或间接地编码一种配体 (激发子 )，它与 抗性 基因编码的产物 (受体 )相互识别后发生作用，从而触发受侵染部位细胞内的信号传递过程，激活其他防卫基因的表达，产生过敏性反应（ R） (et 这种相互识别是一个复杂的过程，包括病原菌通过特定的分泌系统把激发子输送到植物细胞以及在此之前寄主植物与病原菌的感知过程（ Ji et et 。 例如： 拟南芥的 过识别假单胞 菌的 et 在番茄 et 卫模型 (尽管 “ 基因对基因学说 ” 以及 “ 激发子 /受体模型 ” 可以解释很多病原菌与寄主的互作，但更多情况下还是缺乏直接的证据。这种情况下有人提出了 防卫模型 ( 最初 这个模型用来解释 模型认为： 在病原物 侵染植物并营造 适合其生长的有利环境时，病原体把植物体内的一种蛋白作为靶标并加以改变，这种改变是植物受到病原体侵害的信号。植物抗病基因蛋白 (检测到这种信号。当植物抗病基因蛋白 发现其卫兵受到攻击时，抗病性被触发。防卫模型中植物抗病基因蛋白不仅能识别无毒基因蛋白，而且能监视被病原体毒性 /致病蛋白作为攻击目标的重要植物蛋白 /复合体 (et 2002)。 物抗病基因 （ R 植物的抗病性是指植物避免、中止或阻滞病原物侵入与扩展，减轻发病和损失程度的一类特中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 2 性。抗病性是植物与其病原生物在长期的协同进化中相互适应、相互选择的结果，病原物发展出不同类别、不同程度的寄生性和致病性，植物也相应地形 成了不同类别、不同程度的抗病性。病原物的寄生专化性越强，则寄主植物的抗病性分化也越明显。寄主的抗病性仅仅针对病原物群体中的少数几个特定小种，这称为小种专化抗病性（ 具有该种抗病性的寄主品种与病原物小种间有特异性的相互作用。与小种专化抗病性相对应的是非小种专化抗病性（ 具有该种抗病性的寄主品种与病原物小种间没有明显特异性相互作用，是针对病原物整个群体的一类抗病性 。 从广义上讲植物抗病基因 (防御反应基因 (是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。所谓抗病基因就是基因对基因 ( 说中所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因 （ 001） 。植物防御反应基因的特点是，在抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。 目前已经有许多 R 基因被克隆 （ et 。尽管这些基因使寄主株植物分别对真菌、细菌、病毒或者线虫等不同的病原生物具有抗性，但是它们在结构上都具有一定的相似性。它们编码的蛋白一般都具有富亮氨酸重复（ 序或者丝氨酸 酶 结构域 (根据它们编码的蛋白结构特点，通常 划分为 5 个类别 （ et ： 1） 这类基因编码类似胞质受体的蛋白 （ ， 这类蛋白具有一个苷酸结合位点（ 这个家族的基因包括拟南芥中的 茄 中的 草中的 麻中的 基因等等。 2） 丝氨酸 这类基因主要以 苏氨酸激酶，这个激酶与哺乳动物的 3） 这类基因包括番茄中的 及甜菜中的 中 4） 这类基因以 括一个胞外 苏氨酸激酶结构域。 5） 毒素还原酶类 这类抗病基因以 个还原酶可以使 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 3 稻与白叶枯病菌互作的 分子机制 稻白叶枯病 水稻白叶枯病是由 黄单胞杆菌水稻 致病 变种（ 侵染引起的重要的水稻病害。该病害是一种维管束病害，在自然条件下， 入木质部，在其中繁殖，并向导管移动。一旦进入导管， 至导管被菌体和胞外多糖、黄原胶堵塞。如果在苗期或分蘖早期侵染，将会造成稻苗的萎蔫。如果在后期侵染，病斑会沿着叶脉扩展，并逐渐变成灰绿色至黄色。种植抗病品种是控制水稻白叶枯病的主要措施，但因 和新毒性群体的出现，往往使经过多年 培育 的抗病品种在推广种植几年后就失去了抗病性。 近年来，随着水稻全基因组及水稻白叶枯病菌（ 基因组测序的完成，大大方便了对水稻与 于水稻与 此也可以看作是细菌病害的模式病害。目前对该病害的研究从理论上和应用上都取得了许多进展，主要表现在以下几个方面 :（ i）从基因对基因学说角度解释寄主与病原菌的相互作用，通过遗传图谱和物理图谱的构建，对抗性基因进行定位和克隆 ;（ 克隆的白叶枯病抗性基因进行结构和功能研究，寻找抗性基因作用的模式 ;（ 分子水平研究白叶枯病抗性基因和无毒基因的作用模式 :（ 核酸水平和蛋白质水平研究白叶枯病抗性基因的形成和进化 ;（ v）利用分子标记技术和转基因技术， 针 对水稻白叶枯病进行抗性育种 （刘小丰 2006） 。 稻白叶枯病菌无毒基因研究概况 目前已从 中 基因组合，这也证实了 et 李平 等， 2004） 。 稻抗白叶枯病基因研究进展 抗性基因的鉴定是开展抗病性育种的重要基础性工作。通过各国科学家的努力，现在已经鉴定了 30个水稻抗白叶枯病基因。在这 30个基因中， 21个为显性基因 ( 9个为隐性基因 ( 5个基因已经被克隆； 其中 表 1） （章琦 2005） 。 表 1 至 2005年 已鉴定的水稻白叶枯病抗性基因 . of to in up 005. 鉴定基因 命名 用菌株 (小种 ) 表品种 色体 日本菌株 玉， 日本 4 尼菌株 生爱国， 1 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 4 7147,律宾菌 ) 菲律宾菌 ) 菲律宾菌 ) 律宾菌 ) 菲律宾菌 ) 1 菲律宾菌 ) 菲律宾菌 ) 菲律宾菌 ) 定位 菲律宾个小种 1 尼菌系 定位 尼菌系 ) 黄玉， 菲律宾小种 1,2,4,6 菲律宾小种 3,5 日本小种 I,V 未定位 日本小种 V 定位 日本小种 苏稔 未定位 缅甸菌株 阳 23, 丰锦 未定位 6个菲律宾小种 定位 6个菲律宾小种 定位 #* 菲律宾小种 1,2,4,6 长药野生稻（ 11 t)# 扎昌龙 11 菲律宾小种 6 普通野生稻 (11 t) 菲律宾小种 1,2,4,6 定位 t)# # 小粒野生稻 78定位 菲律宾小种 9 明恢 63 12 t)# 抗菲律宾小种 1、 3、 4 和中国 明恢 63体细胞 无性系突变体 定位 t)# 中抗菲律宾小种 13 抗菲律宾小种 5 定位 t)* 中国菌株 恢 63 11 t)#,* 菲律宾小种 2、 5 t)# 菲律宾小种 2 定位 t)# 菲律宾小种 1 药用野生稻 1 *已克隆； # 成抗基因； # #分蘖后期表达抗性； （章琦 水稻白叶枯病抗性基因鉴定进展及其利用 中国水稻科学 2005， 19： 453 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 文献综述 5 稻感病基因研究 根据基因对基因学说，人们推测与病原物毒性基因（ 对应，应该存在感病基因。