【毕业学位论文】（Word原稿）转Bcl、Rip基因小麦后代的鉴定和遗传分析作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 转 因小麦后代的鉴定和遗传分析 cl cl 摘 要 核糖体失活蛋白（ 高等植物中广泛存在的一种毒蛋白。它具有损伤真核细胞核糖体，从而抑制蛋白质合成的功能。由于植物产生的这类毒蛋白对其他生物有毒害，因此认为 它们的功能是对自身的保护作用。 细胞凋亡相关基因，名称来源于 B 细胞白血病 /淋巴瘤 它们通过调节跨膜的电化学梯度而对细胞凋亡进行调节，目前这种基因在动物上研究的比较多，在植物上报道的很少，它控制生物细胞在受到真菌侵染后迅速产生过敏性坏死，抑制真菌的的繁殖和扩展。把这两种基因导入小麦，可获得抗病小麦新种质，在生产实践中具有重要意义。 本研究利用农杆菌介导法获得了小麦转基因植株，然后对转基因植株中外源基因进行连续几代的跟踪检测，选择 出了遗传稳定的转基因株系。并对稳定遗传的转基因株系做了抗病性鉴定。 在对农杆菌介导法转化小麦的研究中发现，小麦幼胚愈伤组织在受到农杆菌侵染后，很难再进一步分化，小麦植株再生率很低。所以我们认为幼胚的难再分化和小麦再生率低是限制转基因成功的瓶颈。 利用分子检测技术，对转基因植株从 3代做了跟踪检测，最终获得了转 定遗传株系 3 个，转 定遗传株系 2 个。对转基因植株分析，发现转基因植株中外源基因在 稳定遗传的 据分子检测检测，对转基因植株进行了遗传分析，发 现在 功能基因 分离符合孟德尔遗传规律；功能基因 稳定遗传的转基因株系进行严格的抗病性鉴定，鉴定结果显示与对照相比，转基因植株对白粉病和全蚀病具有一定的抗性 部分 植株的株高、分蘖、主穗长、主穗小穗数、主穗粒数、穗型等方面进行了调查。发现转基因植株除了在株高方面有明显变异外，其它方面均与对照表现一致。 关键词： 传分析；白粉病；全蚀病 ip( a of in to of of of to by is a of It by of is on on cl is to to be by ip cl,be of in In we by of of is on By of we at of ip s cl 1 be to in 1 by 2 by of to of in of 目录 第一章 绪论 . 1 麦抗病育种 . 1 物抗病的机制 . 1 麦抗性育种研究的回顾与进展 . 2 麦常见的病害 . 3 用于小 麦抗真菌基因的研究 . 5 麦遗传转化的研究进展 . 7 麦常用的转化方法 . 8 响转化效率的因素及转化细胞的筛选 . 10 麦转基因植株的鉴定和后代的遗传行为 . 11 研究的意义、主要内容及技术路线 . 12 题意义 . 12 究内容 . 12 术路线 . 13 第二章 材料与方法 . 14 验材料 . 14 源基因及其质粒载体 . 14 体小麦品种和农杆菌菌系 . 14 剂及耗材 . 14 器设备 . 15 源基因 定的引物 . 15 究方法 . 15 杆菌介导法转化小麦 . 15 用分子生物学方法进行转基因植株的检测 . 17 基因植株的抗病性鉴定 . 23 第三章 结果与分析 . 24 转化结果和再生植株的获得 . 24 转 因小麦 2代的分子检测与纯合株系的 筛选 . 25 1代转基因植株的 测 . 25 1代转基因植株的 测 . 26 2代转基因植株 的 测和稳定遗传株系的筛选 . 27 3代转基因植株的 测 . 29 基因植株的 测结果 . 29 转 因小麦 2代的分子检测与稳定株系的筛选 . 30 测 . 30 测 . 31 测 . 31 转基因植株的 测 . 31 转基因植株的功能鉴定 . 32 转基因植株的白粉病抗性鉴定 . 32 转基因植株的全蚀病抗性鉴定 . 34 转基因植株农艺性状考察 . 36 第四章 结论和讨论 . 38 论 . 38 因和 因导入小麦品种获得了抗病转基因植株 . 38 过连续几代的分子检测获得了稳定遗传的转基因株系 . 38 过分子检测对转基因植株后代的遗传分离分析和外源基因拷贝数分析 . 38 稳定遗传株系的农艺性状考察和抗病性鉴定 . 38 论 . 38 农杆菌介导法转化小麦存在的问题 . 38 转基因植株后代中的遗传分离 . 39 外源基因的整合对转基因植株农艺性状的影响 . 39 转基因对植株育性的影响 . 39 参考文献 . 40 致 谢 . 44 作者简历 . 45 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 1 第一章 绪论 植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因，通过各种方法转移到植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。随着现代生物技术的迅速发展，植物转基因技术方兴 未艾。自从 1983 年首次获得转基因植物后，至今为止据不完全统计，已有 35 个科 120 多种植物转基因获得成功。 1986 年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有 30 个国家批准数千例转基因植物进入田间实验，涉及的植物种类有 40 多种。 种植的转基因植物种类主要有大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、西葫芦和木瓜等。全球范围内转基因农作物的种植面积近年来逐年大幅度增长， 1996 年为 170 万公顷，到 2001 年尽管受到国际关于 议的影响，转基因植物的种植面积仍增长到 5260 万公顷。到 2003 年全球转基因农作物种植 面积达到了 6770 万公顷，比 2002 年增加了 美国 1/4 的耕地面积种植的是转基因作物，种植面积占全球的 其中转基因抗除草剂大豆占美国大豆面积的 55，转基因玉米占玉米面积的 30。 我国植物基因工程研究始于 20 世纪 80 年代初期，并于 20 世纪 80 年代中期将生物技术列入国家“ 863”高科技发展计划。据中国农业生物技术学会 1999 年统计我国正在研究开发的转基因植物种类达 47 种，涉及各类基因将近 110 个，其中与病虫害防治有关的约 62 种。我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家，开创了转基因作 物商品化的先河。从 1997 年 3 月 2002年 2 月，我国农业生物安全委员会共受理 693 项转基因产品安全评价申请，批准 501 项中间实验或环境释放。目前我国有 6 种转基因植物被批准进入商品化生产，分别为华中农大的转基因耐储藏番茄，北京大学的转查耳酮合成酶（ 因矮牵牛，抗病毒甜椒，中国农科院的抗虫棉，美国孟山都公司的保铃棉。其中 1996 年 2002 年抗虫棉的累计种植面积达到了 480 万公顷，国产抗虫棉的市场份额由 1998 年的 10%上升到 2002 年的 棉农增加收益 20 多亿圆。转基因植物的产业化，尤其是转 基因农作物的产业化，带来了巨大的经济效益和社会效益。 麦抗病育种 物抗病的机制 植物抗病性及其机制的研究一直是植物病理学和抗病育种中的热点问题。植物受到病原物侵染后，最常见的表现方式是通过诱导产生过敏性反应，进而激发一系列防卫反应，产生组织或全株抗性。植物普遍存在的抗病机制有两种，即过敏性反应（ 系统获得性抗性（ 这两种抗病机制是直接作用于病原物，在不同的植物与病原 物互作系统中表达内容是一致的。植物将 两种抗病机制的内容程序化并储存在植物抗病体系中，当接受来自病原物方面的信号，程序开启，内容表达。 过敏性坏死是指在植物与病原物的非亲和互作系统中，受病原物侵染的植物快速死亡而形中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 2 成枯斑反应。不同的植物与病原物互作系统中发生过敏性反应时，在细胞、生化及分子水平上的变化基本相同。首先，病原物侵染点细胞进入程序死亡（ 程序死亡是细胞的一种保护性自杀行为，是动物、植物和微生物在个体发育、群体进化或抗逆反应中的一种普遍机制。动 物细胞死亡时，细胞骨架离散，细胞形态改变，细胞质浓缩，细胞器功能丧失，核解。与动物细胞一样，植物细胞死亡时，可能也存在着细胞形态结构的改变和遗传物质的降解。其次，病原物侵染点和周围细胞的细胞壁结构发生改变，细胞壁中结构蛋白氧化交联，木质素沉积，即在侵染点和周围的细胞中防卫反应的基因依次得到系统表达。 交分析表明：首先表达的是植保素合成酶基因，其次是病程相关（ 白基因，其次是细胞壁结构蛋白和木质素合成酶基因。这些发生在细胞、生化及分子水平 的复杂变化，共同构成了植物的过敏反应，它的直接结果是病原物被限制在侵染点的坏死组织中，不能向周围扩展获得充足的营养物质以致死亡。 植物过敏反应受植物中一类被称为 基因调节，且这种调节是负向的。 突变体能自发形成枯斑，从细胞、生化到分子水平都与非亲和病原物激发的过敏反应相同，说明 因是控制细胞程序化死亡的开关，参与形成过敏反应的信号传导。 系统性获得抗性是指植物发生过敏反应之后获得的对病原物的广谱抗性。在时间上落后于过敏性反应，性质类似动物免疫的一种机制。在用非亲和性病原物接种后，数天内形成 续数周到数月不等。 一种可以用化学或遗传方法在生产上加以利用的抗病机制。 植物防卫反应基因被系统诱导表达的结果，特别是 白类基因。 白至少有类。其中有降解病原物细胞壁的酶类，如几丁质酶， 抑制病原物生长的酶类，如过氧化物酶，超氧化物歧化酶，脂氧化酶等；有 破坏取食性昆虫消化系统的蛋白酶抑制剂。大多数 白的功能未知，形成 机制还不清楚。植物形成 ，通常有恒定的 白基因被高水平系统诱导表达，这类基因特称为 因。所以 因是否系统表达，成为判断植物是否发生 分子标准。由于植物防卫反应基因的系统表达，使得植物对该种病原物再次侵染，甚至对不相关的其它病原物的侵染，产生了广谱的类似于动物免疫的特性。 麦抗性育种研究的回顾与进展 提高小麦的抗性（其中包括引起小麦减产的生物和非生物因素的抗耐性能，如抗病害、抗虫害、抗寒性、抗旱 性等 ）历来是育种工作的重要目标之一。由于普通小麦种内基因资源的贫乏和原有抗源抗性的丧失，育种家们已日渐重视借助异种、异属甚至亲源关系更远的基因资源。向小麦转移外源抗性的研究工作早在本世纪初就已开始。经过世界各国科学家的努力，这方面的研究工作大致经历了远源杂交阶段、染色体操作阶段以及基因操作的阶段。 在早期，育种家主要通过小麦与表现抗性的异种或异属植物进行种间或属间杂交，并继以随后的回交程序，亦即通过远源杂交的方法转移外源抗性。然而，此法成功的先决条件是被转移的抗性基因来自同源染色体，因为任何基因的 组合和重组都是以染色体配对为基础的。在同属内，种间基因资源无法或者难以满足育种目标时，势必将这种“外引”（ 大到异中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 3 属物种，于是人们设想同样通过属间杂交后的回交程序去实现这种转移。然而，实践表明，属间的基因转移较种间要复 杂的多，因为携带抗性基因的异属染色体大都和小麦的 3 个染色体组并不同源，因而难以通过正常配对实现这种转移。所幸的是，后来人们发现近源属的染色体组的染色体大都和小麦染色体间多少残留着程度不同的部分同源关系，从而使它们在一定条件下，有可能和小麦的特定染色体发生配 对并提供基因转移的机会。染色体转移阶段的一个重要的特征就是在追踪被转移基因的同时追踪其载体 染色体或其片段。为此目的，研究者所要完成的杂交、回交和按标记性状进行选择的工作外，还有大量的细胞学鉴定和分析工作，其中特别是携带外源基因的染色体或其片段的辨认与验证，并使此类 研究进入到外源基因的染色体标定这一水平。这一阶段大约持续了半个多世纪，这期间的许多技术进步，其中包括组织培养（如胚拯救、花药培养、愈伤组织继代培养等），抗性鉴定技术，加速世代和染色体分带技术，在提高转移的效率和精确性方面发挥了重要的作用。 自从 1992 年获得首例转基因小麦以来，人们就在不断的探索把抗性基因导入小麦的优良品种，以期望得到高产优质、抗病虫害的小麦，这就是基因操作阶段。随着人们对抗病机制了解的不断深入，以及许多抗病基因的不断克隆，目前人们已经利用各种转化技术获得了预期的转基因小麦。所转化的基因除了新霉素磷酸转移酶（ 、草丁膦乙酰转移酶（ 潮酶素磷酸转移酶（ 葡萄糖苷酶（ 标记基因和报告基因外，还包括雪花莲凝集素（ 高分子量谷蛋白亚基因（ 病毒外壳蛋白基因（ 病毒复制酶基因（ ，分别涉及到改良小麦品质和提高小麦对蚜虫、病毒抗性等性状。但由于人们对各种遗传转化体系的机理还不是十分清楚，而且各种转化体系的转化效率普遍较低，重复性差，所以还不能规模化获得抗病转基因植株。小麦主要的病害是由真菌侵染引起的，但目前对小麦抗真菌病害转基因育种的报道还很少，尤其关于赤霉病、纹枯病等。 麦常见的病害 麦常见的真菌病害 由于小麦在我国分布很广，华北、西北、东北和长江流域均有种植，各地病害种类有所不同。全世界记载的小麦病害有 200 多种，我国发生较重的有 20 多种。病害的危害 不仅造成严重的产量损失，而且大大影响小麦的品质。 小麦锈病（ 为小麦叶锈、小麦条锈和小麦秆锈，一直是小麦上的主要病害，历史上曾经几度大流行，损失惨重。 1950 年小麦条锈病大流行，损失小麦 60 亿 后的 10 几年间，小麦叶锈病在华北，小麦秆锈病在东北、华南都曾有过流行，给小麦生产造成了严重损失。由于抗病品种的培育和推广，近 40 余年内未发生过大面积的流行，但小麦条锈病在西北和华北局部地区的某些年份仍发生严重，叶锈病的发生面积也在不断扩大，秆锈病基本未发生过严重危害。小麦叶锈主要危害小麦叶 片，有时也危害叶鞘和茎；条锈病主要危害叶片，也可危害叶鞘、茎秆及穗部，小麦受害后，叶片表面出现褪绿斑；主要危害茎秆和叶鞘，也可危害叶片和穗部。 小麦白粉病（ 一种世界性病害，在主要产麦国均有分布。我国 1927中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 4 年首先发现于江苏省，后逐渐在西南各省和部分沿海地区发生， 20 世纪 70 年代随着矮秆小麦品种的推广和水肥条件的改善，发病面积和范围不断扩大，并向北方麦区蔓延。目前全国已有 20个省市发生白粉病，以西南各省和河南、山东、湖北、江苏、安徽等省发生较重，而且西北、东北麦区也 有日益严重的趋势。 1981 年和 1989 年该病在我国大范围流行，被害麦田一般减产 10%左右，严重地块损失达 2030%，个别地块甚至达到 50%以上。 1990 年河南省白粉病发病面积达260 多万 麦播面积的一半左右，估计产量损失近 4 亿 麦白粉病在苗期至成株期均可危害。该病害主要危害叶片，严重时也可危害叶鞘、茎秆和穗部。病部初产生黄色小点，而后逐渐扩大为圆形或椭圆形的病斑，表面生一层白粉状霉层（分生孢子），霉层以后逐渐变为灰白色，最后变为褐色，其上生有许多小黑点（闭囊壳）。一般叶片正面病斑比反面多，下 部叶片多于上部叶片。病斑多时可愈合成片，并导致叶片发黄枯死。严重时植株矮小细弱，穗小粒少，千粒重明显下降，严重影响产量。 小麦赤霉病 (全世界普遍发生，主要分布在潮湿和半潮湿区域，尤其气候湿润多雨的温带地区受害严重。在我国该病过去主要发生在小麦穗期湿润多雨的长江流域和沿海地区，20 世纪 70 年代以后逐渐向北方麦区蔓延。 1985 年全国大爆发，仅河南省发病面积就达 150 多公顷，减产 病不仅造成产量损失，而且降低小麦品质，使蛋白和面筋含量减少，出粉率降低，加工性能受到明显的影响。 更为严重的是有赤霉菌所产生的毒素对人畜具有毒性，严重感染此病的小麦不能食用。目前世界各国都将检测面粉中的毒素含量作为衡量小麦面粉品质的指标之一。赤霉病在小麦的各个生育期均能发生。苗期形成苗枯，成株期形成茎基部腐烂和穗枯，以穗枯危害最重。被害的小穗最初在基部变水渍状，后渐失绿褪色而呈褐色病斑然后颖壳的合缝处生出一层明显的粉红色霉层（分生孢子）。一个小穗发病后，不但可以向上、下蔓延，危害相邻的小穗，并可深入穗轴内部，使穗轴变褐坏死，从而使上部没发病的小穗因得不到水分而变黄枯死。后期病部出现紫黑色粗糙颗粒（子囊壳 ）。籽粒发病后皱缩干瘪，变为苍白色或紫红色，有时籽粒表面有粉红色霉层。 小麦全蚀病 (一种典型的根部病害，广泛分布于世界各地。 1884 年英国最早记录， 1931 年前后我国在浙江省发现，以后在部分省区零星发生。 20 世纪 70 年代初小麦全蚀病在烟台严重发生，而今已扩展到西北、华北、华东等 19 个省区，全蚀病是小麦的毁灭性病害，引起植株成簇或大片枯死，降低有效穗数、穗粒数及千粒重，造成严重的产量损失。 小麦苗期和成株期均可发病，已近成熟期时病株症状最为明显。幼苗期病原菌主要侵染种子根、地下 茎，使之变黑腐烂，部分次生根也受害。病苗基部叶片黄化，心叶内卷，分蘖减少，生长衰弱，严重时死亡。病苗返青推迟，矮小稀疏，根部变黑加重。拔节后基部 12 节叶鞘内侧和茎秆表面在潮湿条件下形成肉眼可见的黑褐色菌丝层，称为“黑脚”，这是全蚀病区别与其它根腐病的典型症状。重病株地上部分明显矮化，发病晚的植株矮化不明显。由于茎基部发病，植株早枯形成“白穗”。田间病株成簇或点片状分布，严重时全田植株枯死。 麦常见的病毒病害 小麦黄矮病是小麦重要病害之一，它是由蚜虫传播大麦黄矮病毒（ 引起的。感病的小麦表现为代谢紊乱，叶片发黄，植株矮化，有效分蘖减少，穗中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 5 粒数和千粒重降低而严重减产，因而该病有“黄色瘟疫”之称。由于该病的传播介体专化性强，仅局限于植物的韧皮部生长且细胞内病毒含量很低，目前还没有理想的方法来防治该病毒。我国的 4 种株系即 国外报道的 较密切的血清学关系。几乎所有种植小麦的国家均发生过此病， 1978 年美国小麦黄矮病大爆发使其减产60 80%， 1988 年德国发生小麦黄矮病使其冬 小麦减产 40%。我国在 1966、 1970、 1973、 1978、1980 等五年均发生过该病，平均每次产量损失达 20%以上，近年有加重趋势。 用于小麦抗真菌基因的研究 几丁质酶和 几丁质是一种广泛分布于多数真菌细胞壁上的主要成分。它是 最早在 1957 年被 体外无细胞系统中合成。几丁质酶能水解 4物中的 非线性同聚物，即植物中缺少该酶的有效底物。所以几丁质酶可以降解病原真菌细胞壁中的几丁质，破坏细胞新物质的沉积致使病原体死亡，而且产生的细胞壁碎片具有诱导作用，从而刺激寄主植物的抗病反应。 0 (1979)报道，从麦胚中提取的内切几丁质酶对真菌菌丝新形成的孢子具有更大的降解活性。 (1986)用试验证明植物几丁质酶是植物体中重要的抗真菌蛋白。杜良成 (1992)发现，水稻几丁质酶可抑制稻瘟菌 (子和芽管的伸展。 W. (1988)报道曼陀罗的几丁质酶能有效抑制木霉 (布拉克须霉 (孢子萌发和菌丝生长。 (1986)报道纯化的蚕豆几丁质酶能高度抑制绿色木霉的生长，其有效浓度和病原菌感染或乙烯处理后的蚕豆叶片粗提液中的酶浓度相似。蚕豆叶片抽提液的抗真菌活力几乎被蚕豆几丁质酶的抗血清完全抑制，充分说明了几丁质酶是抽提液中抑制菌丝生长的主要成分。最新试验表明，某些几丁质酶还能催化糖基反应。 1989 年 从 分泌液中分离到一种几丁质酶，同时发现它还能抑制淀粉酶活性，从而有效抑制蝗虫等昆虫类。王海波 (1994)等发现蚕豆几丁质酶可以抑制早期若蚜的存活和生殖发育。高等植物中普遍存在着几丁质酶，很多植物病原菌细胞壁的主要成分是几丁质，而植物本身至今未发现几丁质酶底物 几丁质的存在，因此，几丁质酶在防御病原菌真菌侵害中具有重要的作用。平时健康植株几丁质酶的含量较低，但诱导后几丁质酶可在植物体内大量积累。目前已克隆了二十多种植物中的各类型几丁质酶基因三十多个。 是植物受到病原菌侵染后，细胞发生程序性死亡，同时自身放出胞液中储存的有害物质中的一种， 在真菌的细胞壁中却普遍存在，葡聚糖酶可单独或与几丁质酶一起控制真菌的生长，二者通过降解真菌细胞壁的主要成分 而导致菌丝体顶端膨胀破碎，最终死亡。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪 论 6 核糖体失活蛋白基因 高等植物中广泛存在一种名为核糖体失活蛋白（ 毒蛋白。 它具有损伤真核细胞核糖体，从而抑制蛋白质合成的功能。由于植物产生的这类毒蛋白对其他生物毒害，因此认为它们的功能是对自身的保护作用。它们可存在于植物的叶、根、种子等不同部位，或在不同的生理阶段出现，浓度范围从每 100g 植物组织中几 几百 根据肽链的组成和性质，植物来源的核糖体失活蛋白通常被分为三类：型为单链型，分子量通常为 25 32 有 水解真核细胞核糖体的 28S 4324 位腺苷上的 苷键，使核糖体失活；型为双链型， 由一条 类似型核糖体失活蛋白的肽链和一条具有凝集素活性的肽链通过二硫键连接形成，分子量约为 60 型核糖体失活蛋白也为双链，但两条肽链之间通过非共价相互作用结合在一起，且两条链都参与形成 其分子量约为 25 于凝集素的存在，使型和型核糖体失活蛋白可以结合到细胞表面的糖蛋白或糖脂上，增强了它们进入细胞内发挥作用的能力。据推测，这三核糖体失活蛋白可能起源于共同的祖先基因，在进化过程中，有的毒蛋白基因与凝集素的基因融合，就逐渐形成了双链的核糖体失活蛋白。 研究表明，核糖体失活蛋白的抑 制机制是：作用于真核生物 80s 核糖体的 60s 大亚基，使28守环中的一个 N 糖苷键断裂，失去了一个腺嘌呤，由于该保守环区是蛋白延伸因子的结合区域，从而导致核糖体不能再结合蛋白延伸因子，抑制了蛋白质合成的循环。但 对亲源关系较远种类的核糖体具有不同程度的活性，离体研究表明纯化的大麦 有效的抑制植物病原真菌的生长，并且与几丁质酶和 葡聚糖苷酶有协同作用。 2000 人通过基因枪法将 因导入小麦未成熟胚，获得了转基因小麦植株。 近年来的研究发 现，核糖体失活蛋白除了具有 具有多种生