【毕业学位论文】（Word原稿）烟草接种CMV前后CAT酶活与抗病性的关系植物病理学硕士论文

级 _ 论文编号 _ 中国农业科学院 学 位 论 文 烟草接种 后 要 烟草感染黄瓜花叶病毒病 (，体内的过氧化氢酶（ 活性会随之发生变化，且不同抗性品种中其变化幅度不同，在烟草对 抗性鉴定中，以病情指数划分抗病性等方法存在缺陷。如果烟草不同 抗感品种在感染 后体内 活或其变化与抗病性之间存在相关关系的话，应可能作为鉴定抗病性的指标，并克服以前鉴定中的缺点。据此本试验选取不同抗性的烟草品种，测定其接种 后 活，同时调查病情指数，对烟草体内 活与病情指数进行双向分析，旨在找出其间的相关性关系，研究以其作为烟草品种抗病性指标的可行性。取得主要结论如下： 1. 烟草品种的抗病性强弱水平与接种前后 活变化之间并没有确切的规律，相同抗性的烟草体内 活变化可能不同，由此，通过选取不同抗性的一个品种测定其感病前后 中提出通过遗传分析比较相同遗传背景的品种可能是其解决途径。 2. 烟草抗病性与健株体内 活、接种第 8 天病株体内 活呈负相关，即 活越高，病情指数越高，抗病性越弱，这也证明了 的生理功能。 3. 利用 据处理系统，在病情指数和 活之间进行相关性分析，发现健株体内 种后第 8 天 活与病情指数之间存在显著的相关关系，可作为鉴定烟草抗病性的生理指标。 4. 由于病情指数、 活等都受外界条件的干扰，回归方程不 能直接应用，需要引入双参照品种法来对每次评价进行校正，能使预测准确率达到极高的水平。 5. 预期相关的接种前后 活差值与病情指数之间并没有显著的线性相关关系。 关键词：烟草，黄瓜花叶病毒，过氧化氢酶活性，抗病性，生理生化指标 by of s is in in as of If or of it be as to of In of is to of to of to if we as to of as 1 no of of of be in to of So its to of of on of of a of to do in 2 is to in in s to MV of 3 we of in of of MV is of MV is We as to of 4 as we of is by so of is so we of of is 5 is no of of of is as 录 第一章 引言 1 1 烟草感病后体内活性氧的产生 1 2 活性氧清除酶类的活性变化 2 氧化氢酶（ 性变化 3 氧化物歧化酶 (性变化 3 氧化物酶（ 性变化 4 坏血酸氧化酶（ 性变化 5 3 烟草品种 6 4 研究意义和前景 6 5 本研究的主要内容 7 第二章 染前后烟草体内 活变化规律 8 1 材料和方法 8 试材料 8 验方法 9 2 结果与分析 10 情调查 10 11 3 讨论 18 验中烟草抗性水平与前面提到的有所不同的原因 18 同抗性烟草品种接种前后 化是无规律的 19 题可能的解决途径 19 第三章 烟草接种 活与抗病性间的相关性研究 21 1 试验方法 21 验材料、酶活测定、病情调查 21 据处理方法 21 2 结果与分析 21 21 之间的相关性分析 25 29 3 讨论 31 种后第 8 天 活与病情指数之间存在显著相关性 31 种后第 8 天 活与烟草抗病性呈正相关关系 31 32 第三章 烟草苗期 不接种 )与抗病性间的关系研究 33 1 材料与方法 33 2 结果与分析 33 33 37 3 讨论 39 39 39 第四章 利用 活与病情指数间的相关性进行抗病性评价研究 40 1 材料与方法 40 验材料 40 验方法 40 2 结果与分析 41 41 用接种第 8 天 活进行抗病性评价 43 3 讨论 46 能直接应用前面得出的回归方程对其余品种进行评价 46 用线性相关关系引入双参照品种进行抗病性评价 46 述抗病性评价的局限性及其可能解决途径 46 第五章 结论 48 参考文献 50 致谢 56 作者简历 57 图和附表清单 插图 图 1种前后 活 11 图 1晋太 18 号接种前后 活 12 图 1通州接种前后 活 13 图 1神农大叶烟接种前后 活 13 图 1铁把子接种前后 活 14 图 1 14图 1种前后 活 15 图 1种前后 活 16图 1亮黄接种前后 活 16 图 1 17图 1黔 南 8 号接种前后 活 17 附表 表 11个烟草品种 性指数统计表 10 表 1 11 表 1太 18号接种后 12 表 1州接种后 活性的动态变化 13 表 1农大叶烟接种后 活性的动态变化 13 表 1把子接种后 活性的动态变化 14表 1种后 活性的动态变化 14表 1326 接种后 活性的动态变化 15表 128 接种后 活性的动态变化 16表 1黄接种后 活性的动态变化 16表 1种后 活性的动态变化 17表 1南 8号接种后 17 表 2种处理每天 活性与病情指数之间的线性回归分析 25 表 2种处理 活性均值与病情指数之间的线性回归分析 29 表 2种 照 ）与病情指数之间的线性回归分析 30 表 2种 白 ）与病情指数之间的 线性回归分析 31 表 3白处理 活性测定值与病情指数之间的线性回归分析 37 表 3白处理 活性与病情指数之间的线性回归分析总表 38 表 4接检测健株体内 活与病指的回归方程 42 表 4入双参照品种利用健株体内 活预测病情指数结果 43 表 4种处理第 8 天直接检测所得回归方程 44 表 4入双参照品种利用接种处理第 8 天 活预测病情指数结果 45中国农业科 学院硕士学位论文 引言 言 近年来烟草病毒病逐渐成为影响我国烟草生产最重要的病害之一，尤其以烟草黄瓜花叶病毒病（ 烟草马铃薯 Y 病毒病（ 烟草普通花叶病毒病（ 其混合侵染为重。对于烟草，不同品种对病毒病的耐受能力是有差别的。对于植物的抗病性，从遗传学角度， 因对基因”（ 说，认为抗性是植物品种中所具有的抗性基因（ R）和与之相对应的病原物无毒基因（ 合时才得 以表现；从植物生理学角度来看，植物的抗病性是植株在形态结构和生理生化等方面综合的时间和空间上表现的结果，它是建立在一系列的物质代谢基础上的，是有关抗病性基因通过酶蛋白的表达，是靠有关抗病调控物质的产生来实现的薛应龙等 ,1992。结合起来就是， 水杨酸（ 次级代谢产物的生成，并诱导各类防卫反应，如植保素的合成和病程相关蛋白（ 积累等。本部分主要从生理生化角度，就病毒侵染后烟草体内活性氧的产生及其清除酶类（主要包括 ）的活性变化，以及这些物质变化与烟草抗病性之间的相关关系等方面的研究进行概述。 1 烟草感病后体内活性氧的产生 病毒侵染能诱导活性氧 (积累 999; 997，这是植物抗病最早期的反应之一 赵丽坤等 ,2002，这些活性氧主要包括过氧化氢（ 超氧阴离子 (氢氧自由基 ( et 1994; et 1997; et 1998。活性氧的来源及产生部位有多种，大量研究 et 996; P et 997; et 1998表明 , 位于细胞膜上的 化酶、非胞质的过氧化物酶、胺氧化酶和草酸盐氧化酶以及来源于线粒体、叶绿体和过氧化物体的原生质体等都能产生 中与嗜中性粒细胞相似的 化酶途径在植物病原物互作体系中意义重大；而病原物侵染所诱导的活性氧还可来源于乙醛氧化酶等所在的细胞 997; et 1997。活性氧与植物抗病性密切相关，宋凤鸣等的研究得出：病原物侵染及其相关诱发物处理可引起植物体内 宋凤鸣等， 1996。 果表明，光合作用系统中某种活性氧有关复合物的基因沉默，能导致烟草普通花叶病毒（ 累量的增加，加重症状，这在一定程度上也证明活性氧参与了烟草的抗性反应 et 002 。 在相关性，但不同抗性品种活性氧积累量及速度是不同的，一般在非亲和性的抗病反应中 且速度快 et 002。多项试验都表明，植物病原物相互作用中的非亲和互作产生的活性氧水平要明显高于亲和互作 郭泽建等， 2000； et 2001。 2随着膜脂过氧化和症状的出现， 在保护植株（事先接种过病毒并已恢复，体内检测不到病毒，但已获得对病毒免疫的能力）中只在接种后有一个 短暂的 且并未出现明显的膜脂过氧化 et 003。不过也有的研究表明，不论是感病或者抗病烟草品种，受 院硕士学位论文 引言 et 001。由上述看来，活性氧积累是植物普遍存在的抗性反应，不论是抗病或者感病品种病原物侵染后都存在活性氧爆发，只是抗病组合中活性氧积累速度更快，积累量更大。 关于活性氧的可能抗病作用机制近年来研究得比较深入，一般认为包括以下几个方面：对病原物有直接的毒性；触发植物侵染位点的细胞死亡导致过敏性反应（ 是细胞壁蛋白质交联和激活植物保护基因表达所必需的；在水杨酸（ 积累中起信号作用，并诱导系统获得性抗性（ ；直接或间接地调节着与植保素合成相关基因的表达；激活防御基因的表达；导致膜脂过氧化；细胞凋亡 赵丽坤等 ,2002;et 001; 001; et 997; et 003; et 001; et 002。而且已有研究发现， 性细胞坏死（ et 996， 草发生 et 996; 997。 2诱导植物的抗病性表达 et 998， 2果表明在生物或非生物胁迫下， 13种不同的转录本表达被激活 et 003。 前面已对活性氧与植物抗病性的关系 及其活性氧抗病的作用机理进行了概述，如此推想，受病毒侵染后，烟草体内活性氧积累也应该与其品种抗病特性有关联，其一般规律也应该是：抗性品种中积累程度更高，孔凡明等研究烟草感染 孔凡明等， 2002。既然病毒侵染后烟草体内活性氧的变化与烟草抗病性有关，研究其定量变化就有可能成为鉴定烟草抗病性强弱的生化指标，有很大的利用前景。 2 活性氧清除酶类的活性变化 一方面，活性氧在植物抗病中起着重要的作用，但是另一方面，活性氧积累可导致膜脂过氧化和膜差别透性丧失，从而引起一系列生理生化变化， 代谢紊乱，致使植物受到伤害。 导致上述作用外，还可引起细胞生长停滞甚至死亡 et 003。因此在正常情况下，烟草体内存在有一套清除活性氧、防止其毒害的保护体系，使活性氧的产生与清除处于一种动态平衡状态。当生物体中活性氧的产生大于活性氧的清除而打破这种平衡时，细胞内活性氧则急剧积累而使细胞受氧胁迫。由于这些活性氧基团外层自由电子的存在，活性氧比分子氧更活跃，它们能与蛋白质、核酸和脂类发生作用而引起蛋白质失活和降解、 断裂和膜脂过氧等现象，从而导致细胞 结构和功能的破坏。活性氧对蛋白质的损伤是通过糖基化和羰基化来实现的，氧自由基可与酶活性中心的巯基作用，将其氧化成二硫键，造成酶生物活性丧失。活性氧与 啶、脱氧核糖作用，引起 解和修饰，从而影响 复制。活性氧中的 接诱发膜脂过氧化，导致膜组成成分比率改变，膜流动性下降，膜的生物学功能受到破坏 马旭俊等 ,2003。 在这个活性氧清除体系中，以酶系统（包括 ）对活性氧的清除较为重要，在 用下将 化为 2， 的作用下降解为对植物无毒性的 年来植病学家就这些活性氧清除剂变化和植物抗病性之间的关系进行了许多研究，但目前尚未得到一致的结论，详细见下面的分述。不过，已知这些物质变化与植物抗病性有着某种联系，测定不同抗病品种感染病毒病后烟草体内这些活性氧清除剂的动态变化，有中国农业科 学院硕士学位论文 引言 于我们深入了解烟草与病毒之间相互作用的生理生化基础，并有望作为鉴定烟草抗病性的生理生化指标。 氧化氢酶（ 性变化 过氧化氢酶（ 植物抗病性中研究较 多的一个酶，其功能是清除病原物侵染引起的活性氧（主要是 累，将 2O 和 从植物病理学家联想到与活性氧代谢有关的 多研究者对多种病害体系进行了研究，总体趋势是烟草感病后 在各种组合中得出的结论并不完全一致。 所作试验中表明，病毒侵染后 et 2002；玉米的 基因能引起烟草体内 ，这种酶活性提高在限制病原物侵染方面能起到两种截然不同的效果：过敏反应（ 转基因烟草更敏感；在系统获得性抗性 (应中却能有效控制病原物的扩展 et 001。 果表明，转基因烟草接种 斑周围的 应的其枯斑面积也明显增大，不过在系统抗性反应中，转基因烟草与对照并无明显差别 et 002。陈学平等研究烟草感染病品种 陈学平等 ,2002；而孔凡明等在同样的烟草 种后 非亲和互作的早期， 在互作的后期，活性反而低于亲和互作 孔凡明等 ,2002。吴元华等对感病烟草品种 为除最初 性略有升高外，以后活性均低于对照 吴元华等 ,1999。 敏感植株中接种病毒后前 5天 活性升高，以后随之降低；而在保护植株中（以前曾接种过病毒，目前检测不到病毒含量，但是 已获得对病毒免疫能力的植株），并没有发现 活性的明显变化 et 003。到目前为止，烟株感病后体内 一般地认为抗病品种的增减比率低于感病品种，可能是由于抗病品种能尽快地接受病毒侵染信号并迅速传递、及时启动防卫反应的结果。 侵染初期，过氧化氢酶同工酶 2（ 性下降，引起 （ 表达，使其活性升高 et 002。这从 一种水杨酸结合蛋白（ 面也可以解释，病毒侵染后，水杨酸含量增加，结合到水杨酸结合蛋白 1（ 上，引起 制 而提高 能激活病程相关蛋白基因的表达，从而利于植物的抗病反应；反过来，因为植物本身存在抗逆性，植物体内 Z 991。而在转基因烟草中，减少过氧化氢酶的表达量，从而增加烟草体内 现其抗病性明显增强 ，这可能是因为 et 999，这也从另一个方面证明了 加强对这方面的深入研究，可以为选育抗病品种提供依据，同时植株染病后其活性的定量变化有望成为抗感病品种鉴定的生化指标。 氧化物歧化酶（ 性变化 中国农业科 学院硕士学位论文 引言 氧化物歧化酶（ 在细胞防御病毒入侵方面有着十分重要的意义，它能将超氧阴离子自由基 (速歧化为过氧化氢（ 分子氧（ 以避免 同时其产物 能诱导植物发生程序性细胞坏死 et 996; 997，从而抑制病原物的扩展；相反， 不能及时清除，在 存在和一定的生理条件下， 促进 应的进行，将 可通过 对细胞毒性最强的一种自由基 999。 一种含金属的抗氧化酶，在植物界普遍存在而且具有多种类型，这些不同类型的 分子质量和氨基酸序列，而且位于酶活性中心的金属离子也不同。根据 物 过金属离子的氧化还原完成酶的催化功能。 近年来关于烟草感病前后体内 在不同的互作体系中尚未得出一致的结论。孔凡明研究烟草感染 且，侵染早期，非亲和互作体系中 性低于亲和性互作，而在侵染后期，对比关系发生逆转 孔凡明等 ,2002；吴元华等只研究了感病烟草 品种接种 果表明， 性也是先升高后下降 吴元华等 ,1999； 认为对于系统侵染和坏死反应两种不同的互作体系，烟草体内 et 995； 研究表明病毒侵染后 活性迅速降低et 2002。从 所有的研究看来，不同抗感品种活性变化幅度是存在差异的，这一点是毋庸置疑的，尽管对于究竟是抗病还是感病品种变化的幅度更大还未得到一致结论。 性与烟草抗病性之间存在着某种联系， 基因烟草 中 够提高植物对外界胁迫的耐受能力 et 993。据此，有理由推想，烟株感染病毒病后体内 氧化物酶（ 性变化 过氧化物酶（ 植物体内的活性及同工酶谱带变化与植物抗病性有着密切联系。多项试验结果表明，烟草受病毒感染后，不论抗病还是感病品种，体内 不同病害体系中，抗感品种变化幅度存在一定的差异。毛健民等对烟草感染花叶病的研究认为，感病品种 的变化幅度更大 毛健民等 ,2002。而孔凡明等的试验结果表明，烟草 论抗感品种 非亲和互作 凡明等 ,2001。李纯研究烟草感染 发现不论抗感品种， 且各病级间 情越重，酶活越低，即抗病品种 李纯 ,1999。 作试验表明，病毒侵染后 et 2002。从上述看来，不同的组合中，感抗品种之间的变化是复杂的，是 不能一概而论的，这表明云兴福等得出的结论： 性与植物抗病性呈正相关，并不具有普遍性 云兴福等 ,1995。关于 年认为 薛应龙等 ,1992， et 001；而近年来研究者 王海河等 ,2001倾向于认为 上述作用外，在消除活性氧自由基方面具有重要防御作用， 防御系统是性氧自由基可诱导体内 性， 也证明了中国农业科 学院硕士学位论文 引言 在消除活性氧自由基方面的作用 et 001。而 的研究表明，过氧化物酶在将亚硝酸盐（ ）氧化的过程中，使得氧化一氮（ ） 的含量增加，从而激发植物 介导的寄主抗性 et 997; et 999，而 同 et 000。虽然尚不能肯定 性影响烟草对病毒的敏感程度，但健株体内的 生化指标。 坏血酸氧化酶（ 性变化 抗坏血酸氧化酶（ 植物体内一种重要的消除过氧化氢（ 酶类，其过量表达能减少 植物的毒性， et 2004。主要存在于细胞质、叶绿体、线粒体等部位。同时 抗坏血酸是植物体内非酶类活性氧清除系统的组成部分。关于烟草感染病毒后 烟草 毒侵染后，伴随着烟草体内活性氧的产生，编码抗坏血酸 氧化酶的转录本 (平明显升高 et 996，但是另一方面，检测到的抗换血酸氧化酶的水平却是下降的，表明 转录被激活而翻译被抑制，这可能与其生物学功能有关， 性降低能防止 防止病毒的进一步侵染 998；不存在 草感染 et 998。不过 性氧的积累能诱导抗坏血酸氧化酶的表达，这种诱导作用可能是通过谷胱甘肽（ 为中间信号 et 002； （ 活性，病毒侵染后，水杨酸含量增加，结合到 ，抑制 而提高 过来， 活性增加et 995； 明，病毒侵染后 随着细胞的破坏， 活性又有所升高 et 003。关于 分子克隆和鉴别早在1992年就有所突破 et 992。同为 样为水杨酸结合蛋白， 在过敏反应和系统侵染系统中，其变化规律是不一致的，同样，也有望成为鉴定品种抗病性的生化指标。 生物体经过长期进化形成了完善和复杂的酶类和非酶类抗氧化保护系统来清除活性氧 Du et 001。上面我们主要提到 的是各种酶类对活性氧清除的影响，另外，非酶类氧化物有 C. 2001、维生素 A、 坏血酸、谷胱甘肽 et 004、黄酮类化合物 et 999以及一些渗透调节物质如脯氨酸、甘露醇 et 998、血晶素介导的酪氨酸残基 et 002等。抗氧化保护酶类除包括以上谈到的几种重要酶类外，还有谷胱甘肽还原酶（ et 998;2000、谷 胱甘肽过氧化物酶（ et 000、 et 999、脱氢抗坏血酸氧化酶（ 以及一些辅酶等。活性氧的清除涉及一系列细胞代谢和酶促反应过程，单独提高其中的一种酶，对于生物抗氧化能力的提高影响不会很显著，各种抗氧化酶之间的酶活性平衡对于烟草抗病毒可能很重要，其协同作用才能将活性氧类最终转变为水和分子氧而得到有效清除，使得细胞内活性氧的中国农业科 学院硕士学位论文 引言 生和清除始终处于一种动态平衡。在不同的寄主受到不同的病毒侵染时各种活性氧清除酶类活性变化不同是正常的，没有比较的 意义，但若在同种植物（烟草）不同抗性品种感染同种病毒（ 后测定酶类的变化可为烟草抗病性鉴定提供一项有用的生化指标。 3 烟草品种 性研究 关于烟草黄瓜花叶病毒病（ 种抗性及抗源方面的研究到目前为止进行的并不是很多 ,尤其是 80年代之后，关于这方面的研究基本上没有什么进展。上个世纪 60年代初期，前苏联 00份烟草品种和烟属种的 没发现一个免疫或高抗的材料，其中 N. N. 现过敏坏死反应 et 964。 出， 趋向于躲避 入外，在生理方面还有一些因素控制病毒的入侵，其局部坏死斑比其它感病品种小得多，这种抗性表现为两个基因（ t1,控制，而且是非小种专化型的 966， 道，用 种一些烟属种植株，需要较长时间接种，N. N. . 些种植株上， 过来自这些种抗性的双倍体与普通烟草杂交，结果表明，这些抗性由隐性单基因控制 et 970。 个基因控制，其中 . 抗性基因型为 现小面积枯斑。我国台湾 用 两个高产、优质的兼有 2 代的 39000株群体中，选出 7 个抗病植株，并围绕 轮回亲本，进行轮回选择，获得高产、优质、抗病品种，在 80年代育成台烟 6号（ 台烟 7号（ 品种，以及 413、 470品系等，对 一定抗性 et 984。 发现，烟草和 化株系互作时，严重的褪绿斑反应是由病毒的外壳蛋白基因和寄主的两个隐性基因 (制 的 et 993。目前公认的 源主要有 把子、 4 研究意义和前景 研究烟草感染病毒前后活性氧的产生及其相关酶类的活性变化，有助于我们深入研究烟草的抗病毒机理，为培育和筛选抗病毒品种提供理论基础。近年来，黄瓜花叶病毒病逐渐成为影响烟草生产最重的病毒病害之一，不过关