【毕业学位论文】（Word原稿）马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中囊膜基因的变异及LTR的作用预防兽医学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中囊膜基因的变异及 作用 TR h. D. TR 国农业科学院博士论文 摘要 I 摘 要 马传染性贫血病毒（ 反转录病毒科慢病毒属，是马传染性贫血（ 称马传贫）的病原体。我国的马 传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗，该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行，是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（ 病毒复制有重要的调控作用，影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白，由于其基因的高度变异性，受到病毒学研究的普遍关注，通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒 L 株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析，发现二者的 因（尤其是码区）差异较大。 为了研究囊膜基因 程中的作用，我们以 种健康马，从不同时期发热期马血清中以 2基因和 同时以 所得的强弱毒共 30个囊膜基因 弱毒 推导的氨基酸也存在 19个位点极其一致性变异，这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失，其中，氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插 入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒（如 究过程中发现，糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现， 3到 在各自内部相对保守，变异较小。对27个 个非常一致的点突变，没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒 们将马传贫强、弱毒囊膜基因（ 长及部分（ 别连接到逆转录病毒载体 过转染将马传贫强、弱毒囊膜基因整合到包装细胞系 用抗性筛选到稳定表达细胞系；然后将马传贫强、弱毒囊膜基因（ 长及部分（ 转染 293长及部分（ 因的细胞系，为研究囊膜基因（ 长及部分（ 构与功能打下了良好的基础。然而，我们 至今对弱毒 疫苗的致弱机理尚不清楚。对以 染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒囊膜基因之间 据强弱毒囊膜基因变异的分析结果，构建了一系列 图对 过转染驴白细胞并盲传 10代后仍未获得 们推测可能的原因是由于 3响了在驴白细胞上的细胞嗜性。 为了 探讨 毒复制和转录过程中的作用，并进一步研究 致病和免疫机制，我们在已构建 感染性分子克隆和 株前病毒 基因组分子克隆的基中国农业科学院博士论文 摘要 上，用 株的 码区分别替换 感染性分子克隆的相应片段，并以 株的 码区同时替换 感染性分子克隆的相应片段，构建了三个 和 L 株前病毒基因组嵌合分子克隆，分别命名为 、 。通过转染及盲传获得了一株嵌合病毒 。替换了 强弱毒嵌合病毒可以在驴白细胞中有效复制并且产生细胞病变。随后我们进行了马体试验，通过对 构蛋白特异性抗体的监测表明，嵌合病毒可以有效刺激机体产生针对 衣壳蛋白 跨膜蛋白 特异性抗体，但不能有效刺激机体产生针对 附加蛋白 核衣壳蛋白 的特异性抗体，而对照攻毒马在发病至死亡期间均检测到了高水平的 附加蛋白 核衣壳蛋白 的特异性抗体，结果表明，嵌合病毒在马体内是以低水 平的复制长期刺激机体产生免疫应答，从而获得了良好的保护性，对试验马无致病性且可以保护马抵抗致死剂量的强毒攻击。 关键词：马传染性贫血病病毒，感染性分子克隆， 长末端重复序列 ,囊膜基因， 嵌合病毒， 中国农业科学院博士论文 摘要 is a of of up to be as a on is a an on of of of LA TR in To in 2 30 We of 0 a of of or of on IV IV on of 3 5 We of 7 S2 2 or of On of on by 93T 418 a of IV on 国农业科学院博士论文 摘要 IV of To we a on we t We of 3on so t To TR in we , , by or/LA s) on LA NA on on t p9 On p9 中国农业科学院博士论文 目录 目 录 摘 要 . I . 言 . 1 一、马传染性贫血病病毒概述 . 1 1 国内外 株及特性 . 2 2 因及其编码蛋白 . 3 3 因及其编码产物 . 4 4 因及其编码产物 . 5 面蛋白 (SU/. 5 膜蛋白（ TM/ . 6 5 调节蛋白及其编码区 . 7 白及其作用元件 . 7 2 开放阅读框架（ . 8 3 开放阅读框架和 白 . 8 非编码区 . 9 二、慢病毒与糖基化 . 9 1 糖基化 . 10 2 糖基化 . 11 三、本研究的主要内容和意义 . 14 研究报告 . 15 实验一 与其亲本强毒 囊膜基因及 因变异分析 . 15 1 材料 . 16 株 . 16 粒和菌株 . 16 剂 . 16 粒的小量提取 . 16 2 方法 . 16 白细胞的培养 . 16 毒 提取 . 17 、弱毒包含完整 因的扩增 . 17 、弱毒代表性 分基因 的原核表达载体克隆的构建 . 18 、弱毒部分 白的表达 . 18 3 结果 . 18 包含完整 因的克隆与鉴定 . 18 株 苷酸和氨基酸序列比较 . 18 从 株到 基酸比较 . 19 中国农业科学院博士论文 目录 从 株到 基酸点突变 . 23 株 因核苷酸和氨基酸序列比较 . 23 株 因氨基酸变异分 析 . 24 强弱毒代表性 分基因的原核表达 . 24 实验二 马传染性贫血强、弱毒囊膜基因 真核细胞系中的稳定表达 . 25 1 材料 . 26 株及细胞系 . 26 粒 . 26 剂 . 27 胞培养用试剂 . 27 s 液 . 27 酶 . 27 器设备 . 28 2 方法 . 28 组逆转录病毒载体的构建 . 28 组真核表达载体的构建 . 28 染用质粒的纯化 . 28 组逆转录病毒的产生 . 30 达 产生 . 30 测 的表达 . 30 达 293T 细胞系的产生 . 30 疫荧光检测 293T 细胞系的表达 . 30 3 结果 . 30 含强、弱毒 组逆转录病毒载体的构建 . 30 含强、弱毒 组真核表达载体的构建 . 31 、弱毒 组逆转录病毒的制备 . 31 、弱毒 的表达 . 32 达强、弱毒 核细胞系 293T 的筛选 . 32 实验三 系列 . 34 1 材料 . 35 粒和菌株 . 35 剂 . 35 物的合成和克隆或者亚克隆片段的序列测定 . 35 白细胞的分离培养及 胞、 胞的培养 . 35 要仪器 . 35 粒的提取与纯化 . 35 粒的小量提取 . 36 中国农业科学院博士论文 目录 粒的大量提取和纯化 . 36 2 方法 . 37 2.1 、 和 嵌合分子克隆的构建 .