酶的分离和提纯等幻灯片

Chapter5Enzymes 主讲 谢云飞DepartmentofLifeSciencesandTechnologyxie yf 3831928 1 上两次课的内容第一节酶是生物催化剂第二节酶的结构与功能第三节酶的作用机制第四节酶促反应动力学本次课的内容第五节酶的分离 提纯和活性测定第六节重要的酶类第七节酶在医学上的应用 第五章酶 2 第五节酶的分离 提纯和活性测定 Section5theseparation purificationandmeasurationofactivityofenzyme 3 一 酶的分离提纯 目的 研究酶的理化性质 包括结构与功能 生物学作用 作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高 4 根据酶在体内作用部位 胞外酶 易分离胞内酶 须破碎cell 分离提纯的原则 选择酶含量丰富的材料目前多采用微生物发酵的方法来获取大量的酶制剂避免蛋白质变性 避免强酸 强碱 低温每一步骤 都要测定酶的总活力和比活力 5 a 选材动物 植物 微生物 含酶量高 易分离的酶 分离提纯的步骤 选材 破碎细胞 抽提 纯化 保存 6 b 破碎细胞动物细菌植物研磨超声波纤维素酶匀浆溶菌酶捣碎机化学溶剂 甲苯 提取液c 抽提抽提条件的选取应根据酶的溶解度和稳定性等 用稀盐 稀酸 稀碱溶液抽提 盐 一般用等渗盐溶液 如0 05mol L的PBS 0 15mol L的NaCl等 T 一般在0 4 pH在其稳定范围内且远离其等电点 7 操作要求 A 尽量减少酶活性的损失B 低温0 5 摄氏度有机溶剂 15 20 摄氏度C 抽提液加入EDTA 络合金属 D 抽提液加入巯基乙醇 防止 SH氧化失活 E 不能过度搅拌 以免产生大量泡沫 使酶变性F 测定酶的比活力 8 d 纯化小分子能自然去除 大分子中核酸用鱼精蛋白或MnCl2沉淀去除 粘多糖用醋酸铅去除 而主要工作则是去除杂蛋白 纯化方法与蛋白质基本相同 此外常用选择性变性法如选择性热变性法 某些酶耐热 9 纯化方法 选择性变性法盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀方法吸附分离方法几种方法配合使用 10 提纯的目的 含量 纯度工艺的选择应权衡含量与纯度 根据酶的应用目的和经济效益取得一个平衡点 每一步都要测定酶的纯度 比活力 并计算纯化倍数和产率以决定该步骤的效益和取舍 酶的比活力 纯度 活力单位数 毫克蛋白纯化倍数 每次比活力 第一次比活力产率 每次总活力 第一次总活力 100 11 e 保存将酶制品浓缩 结晶 以便保存 20 注意 酶易失活 不可烘干 可用的方法 1 保存浓缩的酶液 2 浓缩液加入等体积甘油 20 长期保存 12 二 酶的活力测定 定量 酶的活力 又称为酶活性 一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力 酶的活力大小可用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示 即可用单位时间内 单位体积中底物的减少量或产物的生成量来表示 一般采用高底物浓度 S 100Km 零级反应 测定初速度来定量酶浓度 13 酶活力单位 最适条件下 单位时间内 酶催化底物的减少量或产物的生成量 1个U 1U 特定条件下 1分钟内生成1微摩尔产物的酶量 或转化1微摩尔底物的酶量 Kat 最适条件下 每秒钟可使1摩尔底物转化的酶量 即1Kat 6 107IU习惯单位表示酶活力 14 酶的转换数 turnovernumber 单位时间 每个催化中心所转换的底物分子数 通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数 在数值上 Kcat K3 15 第六节重要的酶类 一 寡聚酶 oligomericenzyme 含有2个以上的亚基 分子量大 35000以上 可分为含相同亚基的寡聚酶和含不同亚基的寡聚酶 寡聚酶普遍存在 单体酶的数量则较少 含不同亚基的 寡聚酶的不同亚基执行不同的功能 催化功能和底物载体的功能 寡聚酶是代谢调节的方式之一 16 二 同工酶 isoenzyme 概念 存在于同一种属或不同种属 同一个体的不同组织或同一组织 同一细胞 位置 具有不同分子形式 结构 理化性质和免疫学性质 但却能催化相同的化学反应 功能 的一组酶 称之为同工酶 isoenzyme 乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶 17 乳酸脱氢酶同工酶形成示意图 多肽 亚基 mRNA 四聚体 结构基因 ab 18 不同组织中LDH同工酶的电泳图谱 19 同工酶在各学科中的应用 医学和临床诊断 体内同工酶的变化 可看作机体组织损伤 或遗传缺陷 或肿瘤分化的的分子标志 适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要 20 21 关于同工酶的叙述 哪一个是正确的A 是能催化同一反应 但分子组成 理化性质以及免疫学特征都不相同的一组酶B 由同一基因编码 生成相同的mRNA 然后把翻译的蛋白质经加工而形成的不同分子形式的酶C 催化同一反应 理化性质相同 只是分布不同的酶D 催化同一反应 分子组成不同 理化性质相同 免疫学特征不相同的一组酶E 催化同一反应 分子组成和理化性质不同 但免疫学特征相同的一组酶 22 三 诱导酶 inducedenzyme 含量在诱导物存在下显著增高 诱导物是该酶的底物类似物或底物本身 半乳糖苷酶 无葡萄糖时利用乳糖 因为长期服用某种药物而产生抗药性 23 四 调节酶 一般催化代谢反应链中的单向反应或速度最慢的步骤 因而可调节 控制反应链的总的方向和总速度 调节酶一般位于代谢反应链的开端或分枝点上 24 一 共价调节酶调节剂通过共价键与酶分子结合 以增减酶分子上的基团来改变酶的活性 高 低 有 无 常见类型磷酸化与脱磷酸化 最常见 乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化 SH与 S S互变 25 酶的磷酸化与脱磷酸化 26 二 变构酶 别构酶 属寡聚酶 结构 除活性中心外 还有别构中心 结合调节物或称效应剂 别构效应 调节物与别构中心结合引起酶蛋白构象变化 使酶活性中心对底物的结合和催化作用受影响 改变酶活性 从而改变酶促反应速度 别构激活 别构抑制别构效应剂 别构激活剂 通常为底物或底物类似物别构抑制剂 通常为产物 27 同种效应 一分子的配体结合在蛋白质一个部位影响另一分子同样配体在另一部位的结合 异种效应是一分子的配体在一个部位的结合会影响另一分子的不同配体在另一部位的结合 28 协同效应 cooperativity 一个寡聚蛋白质的一个亚基与其配体结合后 能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象 称为协同效应 如果是促进作用则称为正协同效应 positivecooperativity 如果是抑制作用则称为负协同效应 negativecooperativity 29 变构酶的初速度 底物浓度的关系不符合典型的米氏公式 对于变构酶来说 酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感 当底物浓度发生较小变化时 变构酶可以极大程度地控制着反应速度 变构酶可以灵敏地调节酶反应速度 30 一 血清酶测定应用于肝胆疾病的诊断转氨酶血清谷草转氨酶 SGOT 卵磷脂 胆固醇转酰基酶 LCAT 谷氨酰转肽酶 GT 二 血清酶测定应用于急性心肌梗死的诊断肌酸激酶 CK MB高6倍 乳酸脱氢酶LDH H1 H2高 三 血清酶测定应用于诊断肿瘤 GTGal T 第七节酶在医药学上的应用 一 酶在疾病诊断上的应用 31 1 助消化酶2 消炎酶3 防治冠心病用酶4 止血酶和抗血栓酶5 抗肿瘤酶类6 其他酶类药物 二 酶在治疗上的应用 32 固定化酶 借助于理化方法把酶束缚在一定空间内并仍具有催化活性的酶制剂