分子生物学 第三章 DNA的复制和修复ppt精选课件

.,第三章DNA的复制,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。,.,DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。,.,在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就丰富了中心法则的内容。,.,DNAdependentDNApolymeraseDDDPDNAdependentRNApolymeraseDDRPRNAdependentRNApolymeraseRDRPRNAdependentDNApolymeraseRDDP,.,.,第一节DNA复制概况,一.DNA复制的半保留性DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。,.,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：,.,二.复制子（replicon),复制子:基因组中能单独进行复制的单位。每个起始点到终止点的区域为一个复制子。,.,1.起始点（originofreplication,ori),原核生物DNA分子中只有一个起始点，长度200bp左右。大肠杆菌oriC有245bp。真核生物有多个复制起始点。,.,.,E.coli中的Ori区富含AT和回文对称的序列。这种特殊的结构与复制起点易于解链以发动DNA复制（形成“呼吸现象”）和促进聚合酶与DNA结合的功能高度统一。,.,isolationofori,.,.,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,.,2.终点（ter）,对E.coliDNA复制过程的研究发现，其两个复制叉总是在一个固定的位点相遇，这个特殊的位点包含两个分别由3个终止子（terminus）组成的终止区域terE，terD，terA和terF，terC，terB，其中每个终止子含有相对保守的22bp序列（有说23bp共有序列？），分别负责对不同区域的复制叉行使终止功能。,.,目前已经分离出相对分子质量为3.6103的终止蛋白Tus（terminusutilizationsubstance）。这种终止蛋白能识别ter序列，形成terTus复合体，以防止DNA过度复制，避免出现DNA多聚体。,.,为了保证DNA复制的完整性，每一个复制叉必须穿过另一复制叉的终止区才能到达自身终止区，并可以在其中3个位点的任一个位点发生终止。如果两个复制叉的延伸速度不一致，或因某种原因一个复制叉的延伸过程被拖延，先期到达终止子的复制叉会停留等待另一复制叉的经过，共同完成全基因组的复制过程。,.,三.复制的方向性,复制的方向：单向或双向,.,.,.,双向复制DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,.,.,.,.,四.引物RNADNA复制的起始必须先期合成一段引物分子。研究表明无论是原核生物还是真核生物，大多数引物复制是一段长度不等的，一般为10个核苷酸左右的RNA分子。（有说为110个核苷酸？）,.,所有DNA聚合酶具有一个共同的特点均不能自主地发动DNA的复制，只能利用已提供的核苷酸3OH末端聚合dNMP，合成DNA链。它们必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。引物RNA的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。,.,五.DNA的半不连续复制由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。,.,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为前导链(leadingstrand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为滞后链(laggingstrand)。,.,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，滞后链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由滞后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,.,第二节参与DNA复制的酶、相关蛋白及酶学机制,在细胞中，双螺旋DNA复制是DNA聚合酶催化的酶促反应过程。但DNA聚合酶只能延长已有的DNA或RNA引物链，不能从头起始DNA链的合成,.,另外，在DNA复制中形成特殊的复制叉（或生长叉）结构区内，DNA双螺旋中的两条链缠绕在一起，要拷贝每一条链都必须将双螺旋DNA解旋（unwinding），并释放或吸收由此产生的扭力，这就要求双螺旋和超螺旋的解旋与重新形成DNA聚合酶不能完成这一过程,.,在不连续合成中形成短的冈崎片段（Okazakifragment）的连接也是DNA聚合酶无法完成的。实际上，在复制叉处进行复杂的DNA复制过程中，需要许多相关的酶和蛋白因子参与。,.,除DNA聚合酶外，还包括：DNA旋转酶；使DNA双股链在复制叉解开的解旋酶；在DNA复制前防止解开的DNA单链局部退火的DNA结合蛋白；合成RNA引物的酶；除去RNA引物的酶；使冈崎片段共价连接的DNA连接酶等重要的酶与蛋白因子。,.,DNA聚合酶、引物的引发酶、DNA解旋酶、单链结合蛋白、连接酶等在内的如此众多的酶分子均集中在复制交叉处组成一个复合体协同互作，共同完成DNA分子的复制过程，这种复合体也称为DNA复制体（replisome）。,.,一.DNA聚合酶,（一）原核生物DNA聚合酶种类在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶（DNApolymerase,DNApol)有五种:DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）、DNA聚合酶（DNApol）,.,前三种酶（DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。DNA聚合酶催化DNA新链中脱氧核苷酸之间的聚合反应的酶。参与DNA复制的主要是pol和pol。,.,.DNA聚合酶I,1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取DNA聚合酶I。大肠杆菌K-12株的DNA聚合酶I由基因polA编码，由928个氨基酸组成，分子量103.1kDa，结构类似球状，直径约650nm，每个细胞约有400个分子。,.,此酶的模板专一性和底物专一性均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。,.,1）聚合作用：53；2）35外切酶活性：校对（或正）功能；3）53外切酶活性：引物切除、损伤修复，主要功能是切除引物、填补冈崎片段产生的空隙及DNA损伤的修复；,.,.,.,如果新链合成过程中出现错配，新添加的核苷酸因为与模板不能正确配对，将形成单链尾巴，此单链末端可被DNA聚合酶识别，并以3-5外切酶活性切除此核苷酸，再用其聚合酶活性配对正确的核苷酸，此功能被称为校读功能。,.,DNApol是单一肽链的大分子,分子量为109kD,二级结构以-螺旋为主。用特异的蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶）处理，可把DNApol水解为两个片段，即在F，G螺旋之间发生断裂。,.,小片段，具有323个氨基酸残基，小片段的分子量为35KD，具有53外切酶活性。可以逐个切除处于配对状态的具5磷酸末端的核苷酸，一次最多可以切除10个核苷酸。,.,大片段或称Klenow片段，具有604个氨基酸残基，分子量为68KD，具有DNA聚合酶活性和35外切酶活性；53聚合酶活性使Klenow片段可以3OH末端添加新的核苷酸延长已存在的多核苷酸链。,.,3-5外切酶活性则令Klenow片段可以从DNA的3端，即新链生长端开始逐个切除核苷酸。此活性倾向于切除DNA合成中的末端错配碱基。,.,以上三重活性相结合，使DNA聚合酶I适用于取出起始DNA合成所需的RNA引物，并填充去除引物后DNA双链中出现的短单链区域。,.,类似的短单链区域也可出现在DNA损伤修复过程中切除错误碱基后，故DNA聚合酶I也可用于损伤DNA的修复。但DNA聚合酶I的延伸能力不强，与模板接合一次只能使核苷酸链延长20-100个核苷酸，在新链的延长反应中不可能起主要作用。,.,pol为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment，具有53聚合酶活性和35外切酶的活性。,.,.,.,2.DNA聚合酶II,DNA聚合酶II具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性。,.,3.DNA聚合酶III,该酶由10个亚基组成，分别为、及。DNA聚合酶具很强的延伸能力，能在新链上每分钟添加105个核苷酸。它是原核生物体内真正起复制作用的酶。,.,亚基：53聚合酶活性；亚基：35外切酶,校对和编辑；为装配必须；以上三者构成核心酶。,.,DNA聚合酶为不对称异源二聚体,每个DNA聚合酶含有二个拷贝的核心酶，另外有二个拷贝的二聚化亚基连接这二个核心酶；二个拷贝的亚基负责保持核心酶与模板链的结合并使酶能够沿模板链移动；另外五种亚基组成复合体，可促进全酶组装并使亚基结合到DNA上。,.,大肠杆菌DNA聚合酶,.,pol由十种亚基组成，其中亚基具有53聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而亚基具有35外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。,.,大肠杆菌DNA聚合酶全酶的结构和功能,延长因子,DNA聚合酶异二聚体,核心酶,校对,引物的结合和识别,促使核心酶二聚化,.,前导链与后随链复制的方向不同,位于前导链DNA延伸点的复制体在完成一个冈崎片段的复制后必须解体，或以复制体整体方式才冈崎片段的末端解离后又迅速“调转车头”结合到新的起点合成冈崎片段。在大肠杆菌中完成一次基因组复制，复制体需要启动20004000次的冈崎片段的复制。,.,显然这种模式是不符合生物进化的“经济原则”的。随后的研究证明每一个复制叉均含有一个DNA聚合酶的二聚体，它可以同时催化前导链和后随链的同时复制。基于这一科学发现，人们提出了在双链DNA复制进程中“回环模型”。,.,回环模型,即在复制叉处仅有一个大型的DNA复制体，后随链的一个冈崎片段模板DNA以倒退的方式从DNA聚合酶中将模板DNA释放出来，新冈崎片段的DNA单链与前导链一样，以相同的方向完成复制。以滚环模式扩增DNA的生物在复制叉处也是按回环模型完成DNA复制的。,.,.,聚合酶III核心酶,大肠杆菌复制体结构示意图,聚合酶I,聚合酶III核心酶,滞后链,前导链,解螺旋酶,引物合成酶,RNA引物,引发体,拓扑异构酶II,-夹子,-聚体,-夹子,-复合物,RNA引物,单链结合蛋白（SSB）,.,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,.,.,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA复制的主要聚合酶，还具有3-5外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）,.,DNA聚合酶的3-5外切酶水解位点,3,3,5,5,错配碱基,.,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5-3核酸外切酶水解位点,单链缺口,5,.,DNA聚合酶和是在1999年才被发现的，它涉及DNA的错误倾向修复(errorpronerepair)。当DNA受到较严重损伤时，即可诱导产生这两个酶，使修复缺乏准确性（accuracy)，因而出现高突变率。高突变率虽会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活。,.,（二）真核生物中的DNA聚合酶,在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol），DNA聚合酶（pol）。,.,其中，参与染色体DNA复制的是pol（延长滞后链）和pol（延长前导链），参与线粒体DNA复制的是pol，pol与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，pol只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。,.,其他学者的意见：真核生物DNA聚合酶,、及四种，都有53聚合功能。及参与核DNA复制；：链合成的引发，：链的延长pol；切除引物后填补空隙：外切核酸酶：线粒体DNA复制,.,定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核3-5外切-+酶活性功能,引物合成,修复作用,线粒体DNA的复制,核DNA的复制,？,真核生物中的DNA聚合酶,.,至今为止，所有已发现的DNA聚合酶都不能从头合成多核苷酸链，而只能通过从3OH末端添加新的核苷酸延长已存在的多核苷酸链。此特性决定了复制中新链的合成方向。,.,（三）DNA复制的保真性（即忠实性）为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1遵守严格的碱基配对规律；2DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3对复制过程中出现的错误及时进行校正。合成时以RNA为引物,.,DNA聚合酶的校对功能,.,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,.,DNA复制为什么要合成一个RNA引物，而后又把这个引物消除呢？,这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA开始聚合以后再以53外切酶的功能切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,.,二.DNA旋转酶与DNA超螺旋的松驰,天然DNA的负超螺旋虽然有利于DNA的解旋，但随着复制的进行，复制叉前方亲代DNA中仍积累巨大的张力，因此复制中需要DNA旋转酶去除解螺旋酶的解链产生的扭曲张力。,.,大肠杆菌中的DNA旋转酶（gyrase）又称拓扑异构酶（topoisomerase），由四个亚基组成四聚体22真核的呈二聚体。DNA旋转酶的作用机制如图5-6所示。,.,图5-6DNA旋转酶引入超螺旋的分子模型：DNA双链以右手方向绕在四聚体的酶上；：DNA双链被切断，两个亚基以其连接处为铰链转动，张开其靠近DNA断裂点的部分；：未断的DNA双链穿过切口；：连接断裂的DNA，以左手方向绕在酶分子上；：连接好的DNA释放出来。,.,：DNA双链以右手方向绕在四聚体的酶上；：DNA双链被切断，两个亚基以其连接处为铰链转动，张开其靠近DNA断裂点的部分；：未断的DNA双链穿过切口；：连接断裂的DNA，以左手方向绕在酶分子上；：连接好的DNA释放出来。,.,DNA旋转酶每作用一次产生两个负超螺旋，因此可以消除复制叉向前移动所产生的正超螺旋，并且复制完的两个子代DNA双链的分离也需要DNA旋转酶的催化功能。当加入DNA旋转酶的抑制剂如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixicacid）等时均能抑制细菌DNA的合成。可见DNA旋转酶是DNA复制所必不可少的。,.,拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。,大肠杆菌拓朴异构酶的结构,.,DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase)：拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。例：大肠杆菌中的蛋白拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,.,DNA旋转酶对真核细胞有丝分裂也是非常重要，如果不解开缠绕，在任何细胞周期中姐妹染色体都将无法分离。此外，DNA旋转酶在转录、同源重组及可移动元件的转座中都起重要作用。,.,三.DNA解旋酶,复制过程中，复制叉在不断前进，复制叉前方的亲代DNA就需不断解链，为使复制能够顺利进行，就必须防止DNA单链的链间或链内局部“退火”并保证其完整性与伸展性，使单链DNA处于稳定的状态。承担上述任务是DNA解旋酶（DNAhelicase）和单链DNA结合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）。,.,DNA解旋酶是很多细胞过程所要求的（如核苷酸切除修复、同源重组、转录终止）。DNA解旋酶是利用ATP水解获得的能量来打断氢键，解开双链DNA并在DNA分子上沿一定方向移动的一类酶的总称（又称解链酶）。原核生物大肠杆菌为DnaB和Rep蛋白，DnaB结合于滞后链模板沿53方向前进，Rep蛋白结合于前导链模板沿35方向移动（图5-7）。,.,8、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase)通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。,rep蛋白沿35移动，而解螺旋酶I、II、III沿53移动。,.,DNA解链酶解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解链酶。,.,真核生物病毒中大T-抗原（T-antigen,T-ag）具解开双链的功能。此外也在一些真核生物中分离纯化出多种DNA解旋酶，其功能还在鉴定证实中。,.,图5-7DNA双螺旋的解旋,.,四.单链结合蛋白,单链DNA结合蛋白（SSB），又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。在细胞内行使很多涉及单链区域稳定性的功能（如同源重组）。其作用为：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,.,在复制中，这包括稳定熔解起点，维持解旋酶活性，从DNA模板上去除二级结构以及抑制核酸酶活性。即SSB与DNA单链相结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺利进行。在E.coli中SSB为四聚体，对单链DNA有很高的亲和性，但对双链DNA和RNA没有亲合力。,.,它们与DNA结合时有协同作用，即有一个SSB与DNA结合时，就会有更多的SSB迅速结合上去扩展分布整个DNA单链，将DNA包被上蛋白聚合体。SSB有某些碱基组成的倾向性，但很少有顺序专一性结合，可以周而复始地循环使用，在DNA的修复和重组中都有SSB的参与。,.,单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,.,五.引发酶与引物RNA的合成,已经证明，DNA的半不连续复制中，DNA聚合酶不能从头起始新的DNA链合成，只能在已有引物的3端向前延伸。迄今为止，人们所发现的引物大多为一段RNA，其长度和序列随着基因组的种类而表现出不同，在大多数情况下为110个核苷酸（表5-3）。,.,表5-3DNA复制中滞后链前体片断的RNA引物,.,DNA复制中以RNA作引物的实验证据是噬菌体M13的DNA复制对转录抑制剂的敏感性实验提供的，其结果指出RNA可能提供了DNA复制的3端。此外，Reiji等设计的实验也证明RNA引物是DNA复制必须的,.,Reiji等设计的实验,即利用含甲苯的缓冲液处理大肠杆菌以提高该菌对外源核苷酸的通透性，然后再以大肠杆菌与-32P脱氧核苷三磷酸（dNTP）和未标记的核糖核苷三磷酸（NTP）的混合物保温，最后从大肠杆菌分离DNA和用稀碱处理。碱性水解发生在3,5-磷酸二酯键的磷酸基与C-5间，这样就使dNTP的放射性磷转移到核糖核苷酸上去（图5-8）。,.,结果发现，每一冈崎片段都产生一个RNA-DNA接头，说明DNA的复制是以RNA为引物。,图5-8RNA引物存在的实验证明,.,催化RNA引物（RNAprimer）合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别DNA单链模板特异顺序，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸产生3-OH，为DNA聚合酶起始生成磷酸二酯键提供条件。合成冈崎片段引物分子的RNA聚合酶与负责RNA转录的RNA聚合酶是完全不同的两种酶类。,.,引物与典型的RNA（如mRNA）不同，它们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。在转录的过程中，RNA分子是RNA聚合酶作用下的产物，合成出的RNA分子会与模板DNA链分离。在E.coli中合成冈崎片段引物分子的RNA聚合酶由dnaG基因编码，这种RNA聚合酶也称为引发酶（primase）。,.,E.coli的引发酶是一条肽链，分子量为60000，每个细胞中有50100个分子。该酶单独存在时是相当不活泼的，只有在与有关蛋白质相互结合成为一个复合体时才有活性。这种复合体就称为引发体（primasome）。引物分子为DNA聚合酶合成DNA分子提供了启动聚合的3OH末端。,.,机体选择RNA作为引物，其原因可能在于减少致死突变（lethalmutation）。DNA复制中，从模板拷贝最初的几个核苷酸时，由于碱基堆集力很弱，其氢键结合能力也很弱，因而碱基对的错配几率就大很多，加上这几个核苷酸还没有与模板形成稳定的双链结构，DNA聚合酶35校对功能很难发挥作用。,.,因此为了保证生物DNA复制的保真度，采用以RNA为引物这种过渡形式，既为DNA聚合酶提供3-羟基端，又容易被DNA聚合酶识别而停止其聚合作用，且便于DNA聚合酶进行切口平移。切口平移过程中发生错误的几率极少，因为DNA聚合酶（polI）有35外切核酸酶活性，具有校对功能。,.,无论是前导链还是后随链的引物均为RNA分子，当DNA复制完成后，必须将RNA引物分子降解。研究证明，相对分子质量为103103的DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶处理后，C端形成相对分子质量为68103的大片段，N端形成相对分子质量为35103的小片段，大片段具有从5向3方向的聚合DNA功能和从3向5的外切校正功能，但效率较低，也称klenow片段。小片段具有从5向3方向的外切核酸酶功能。,.,六.DNA连接酶,DNA连接酶(DNAligase)，1967年发现若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但它不能将两条游离的DNA单链连接起来在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用,.,DNA连接酶催化的条件是：需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。,.,DNA连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,.,第三节DNA复制过程的总结及其调控,DNA复制通常是从双螺旋的特定位置复制原点（ori）开始，一般是富含A-T的区段该区段的双链DNA具有较强的呼吸作用（breathing），是经常瞬间处于打开形成单链的区段（frequentlyopeningregion）,.,.,由此产生的瞬时单链与SSB蛋白（single-strandedDNAbindingprotein，SSB）结合，对复制的起始十分重要。原核生物的复制原点通常为一个，而真核生物则有多个特定的复制原点。,.,依DNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式复制。,.,复制主要以双向等速进行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的复制；部分是单方向进行，如质粒ColE1的复制；或以不对称的双向方式进行，如线粒体DNA的复制。,.,一.复制的起始,DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。1.预引发（1）解旋解链，形成复制叉由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。,.,单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。对于双向复制而言，形成的两个复制叉向相反方向行进，每个复制叉上的两条DNA链均被拷贝。,.,图5-12复制叉（箭头表示子链总的生长方向）,.,（2）引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。2.引发在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3端自由羟基（3-OH）。,.,DNA半不连续复制的模式说明，双链DNA分子复制起始时从复制原点处DNA分子解链，前导链在一段RNA引物的发动下连续合成的模式完成合成过程，而后随链是按不连续合成的模式不断地完成冈崎片段的合成，而每个冈崎片段都需要有RNA引物的发动过程。,.,RNA聚合酶抑制剂利福平对DNA复制的起始也具有明显抑制效应。但一旦复制的起始过程完成后，利福平的抑制效应也随之消失，表明前导链的RNA引物是由RNA聚合酶合成的。如同基因转录过程一样，此RNA聚合酶可以使双链DNA分子局部开链。,.,RNA聚合酶在合成1012个核苷酸RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前导链DNA合成；在完成10002000个核苷酸的DNA合成后，后随链才在引发酶的作用下开始冈崎片段的引物RNA的合成。这一过程也称为DNA复制的转录激活。,.,二复制的延长1.聚合子代DNA由DNA聚合酶催化，以35方向的亲代DNA链为模板，从53方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶；在真核生物中，是DNA聚合酶(延长滞后链)和（延长前导链）。,.,.,2.引发体移动引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，滞后链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。,.,.,三复制的终止1.去除引物，填补缺口在原核生物中，由DNA聚合酶来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。,.,2.连接冈崎片段在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。,.,大肠杆菌染色体复制的终止,ori,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶,连锁染色体,.,四染色体多复制子复制的非一致性,原核生物在染色体DNA复制完成之前，复制起始点可以连续发动新一轮的复制起始，表现为多个复制叉的特点。,.,而真核生物染色体DNA虽多为多复制子，但每一个复制子在一个细胞周期中只启动一次，对每一个复制子来说，无论复制完成得早晚，都必须等待到下一个细胞周期开始后才有可能发动新一轮复制。,.,成千上万个独立的复制子看似在“同一起跑线上”，其实每个复制子发动复制的先后时序有很大的差别。而且这种时序的差别明显地表现在同一染色体的不同复制子之间，表现在不同类型的细胞之间。,.,将啤酒酵母中克隆到的复制起点序列（ori）构建成一个环状的DNA分子，再导入到酵母细胞中，发现它可以启动环状的DNA分子自主复制，将这段富含AT碱基并在不同复制子中较为保守的序列称为自主复制序列（autonomouslyreplicatingsequences，ARS）。,.,果蝇受精后可检测处于开放状态的ARS从5000个上升到50000个，发育早起的复制子的长度仅有7.9kb，而发育到成虫时复制子的长度可以增加到40kb，可见此时许多ARS已处于关闭状态。,.,尽管这种调控的机制目前还不甚了解，但复制子变化规律表明，复制子的多少与DNA复制的速度有关，而完成全基因组的复制与细胞、组织及发育状态有关，表现了多复制子复制启动的非一致性。,.,五DNA复制的调控,与基因表达调控一样，DNA复制调控的关键环节是起始过程的转录激活效率，同时细菌的培养试验表明，细菌的繁殖速率与营养条件（特别是氨基酸饥饿状态对复制的影响），及多种专一性蛋白因子的浓度密切相关。,.,细菌的严谨型质粒和松弛型质粒，相容性质粒和不相容性质粒之间的差异都表现在复制起始调控上，这种调控机制是自然选择中的先后适应。对原核生物DNA复制调控研究最为详尽的是ColE质粒。,.,位于复制起始原点ori上游555nt处有RNA转录起点，朝向ori方向转录RNA。当转录通过原点ori后RNA被NaseH酶切，产生的3OH为DNA聚合酶提供引物，发动DNA复制，从某种意义上讲RNA的转录对DNA复制是一种正控制的激活过程。,.,但与此同时，在原点ori上游445nt处的另一极性单链上还有一个转录起点，背向ori方向转录RNA，并与RNA分子之间有110nt的互补序列。实际上RNA作为RNA的反义RNA，以负控制的方式参与DNA复制的调控。,.,RNA/RNA配对成双链后形成3个茎环结构，从而阻止了NaseH对RNA的酶切，在ori区域不能形成DNA聚合酶的引物，复制过程被抑制。RNA和RNA分子的转录启动又受到Rop基因的负控制调节。,.,当RNA的转录到达ori原点下游不远的地方时，使编码63个氨基酸的Rom蛋白基因表达，Rom蛋白在RNA存在的情况下，可限制RNA只转录到达100200nt将行终止，不能到达ori原点，也不能产生DNA聚合酶的引物。当RNA的转录到达200360nt以后，Rom蛋白又会促进RNA与RNA互补形成双链。,.,但当RNA超过360nt以后，虽然RNA和RNA之间也可形成双链，但此时的双链二级结构并不影响NaseH对RNA的酶切和引物的形成。由此可见，Rom蛋白对复制调控是通过RNA/RNA形成特异二级结构而体现的，而且这种调控也只是在RNA转录的特定时刻才具有效应。,.,第四节线性DNA复制避免5端短缩的机制,一、T7噬菌体方式共联体假说1972年J.D.Watson根据从被感染的菌体中分离得到T7噬菌体的串联体（concatemer），最终提出线性DNA避免5端短缩的共联体假说。这一假说认为在线状DNA分子在5末端的单链缺口处互补，形成共联体。现已证明T7噬菌体全基因组有39936bp，在编码的41个基因中，已鉴定了的34个基因产物，确定了26个基因的功能。,.,复制起点位于距离端点17%处。在线状DNA分子的两端具有同源性很高的167bp的正向重复序列（丰足末端），其中有一个RNase切点。,.,当两条子代DNA合成出后，随即在被切除引物RNA的缺口处互补配对形成双链，RNase在切点处进行错位酶切产生3OH并游离处部分单链模板。DNA聚合酶即可利用3OH末端缺口的补齐。,.,二、腺病毒2方式,腺病毒2（adenovirus2）是一种较大的线状DNA病毒，其基因组全长为35937bp，线状DNA分子两端具有103106bp，富含AT并且第一个核苷酸对为C/G的反向重复序列（），其中包含50bp的复制起点。DNA的复制按单链置换式（standdisplacement）分别先后从两个末端起始。,.,一种相对分子质量为8.0104的末端结合前体蛋白（preterminalprotein，pTP）被剪接为成熟的相对分子质量为5.0104的末端结合蛋白（TP）后，与单链结合蛋白（SSB）一起结合病毒DNA的3末端。,.,在完成一条子代DNA分子复制后，被置换的另一条DNA分子以其IR序列配对形成“锅柄式”（panhandle）的发卡状结构，锅柄处的部分双链结构在TP，pTPSerdGMP等因子的作用下按同样的方式完成DNA的复制。,.,腺病毒按这种方式构成复制起始复合体中不需要引发酶合成的RNA引物，从而避免了5末端切除引物分子后形成5端短缩形象。,.,三、痘病毒方式,痘病毒（poxvirus）双链DNA分子的两端具有闭合的环状发夹结构。DNA复制从中部原点起始，双方向展开，使末端发夹部分转换为双链，并使两条双链DNA分子连接成类似于双链环状结构的共联体。,.,核酸酶从双链分子内部进行错切，共联体解体，游离出包含有末端反向重复序列的单链，末端自行折叠，连接成两条双链痘病毒DNA分子。,.,四、微小病毒方式,微小病毒（parvovirus）是啮齿动物的单链线状DNA病毒，基因组大小为4800bp，具有重叠基因但只编码3个蛋白质。虽然微小病毒DNA的复制全部利用宿主的所有酶系统并与寄主同步，但微小病毒单链线状DNA的两端结构的特异性决定了其在避免5端短缩机制上的特殊模式。,.,在微小病毒单链线状DNA的两端各自一段序列不同的反向重复序列，这一结构导致5和3端折叠，各自形成一段短的双链发夹结构。复制启动时，DNA聚合酶可直接利用3OH，以单链DNA分子为模板，合成出一条完整的双链发卡分子。,.,核酸酶进而在模板链中的反向重复序列处切割，DNA聚合酶再行利用暴露的3OH，以游离出包含反向重复序列5末端为模板，合成出一条完整的双链DNA分子，两端的反向重复序列可再次形成双链发夹结构，启动新一轮的DNA复制。,.,五、真核生物方式端粒的形成与端粒酶(telomerase),端粒（telomere）:真核生物线性染色体3末端的一种特殊结构，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。这些重复序列和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物。人的DNA端粒含有TTAGGG重复序列，长度515kb。作用：保护染色体末端免于化学修饰或核酸酶降解；解决染色体复制时末端丢失问题。,.,.,端粒酶（telomerase）,端粒酶（Telomerase）:是一种RNA-蛋白质复合体，兼有模板和逆转录酶两方面的作用。它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,.,1995年，JunliFeng等克隆了人类端粒酶RNA基因，长约450个碱基的RNA序列中有一段长11个核苷酸的区域（5-CUAACCCUAAC-3）与人的端粒序列（TTAGGG）n互补。端粒酶蛋白质的分离：四膜虫端粒酶两个多肽成分p80和p95。,.,端粒酶(telomerase)的作用机制,.,.,.,端粒合成的一种模型,整合和杂交,.,端粒与衰老,实验：在无端粒酶活性的成纤维细胞中表达端粒酶时，端粒的缩短和细胞的衰老都受到抑制。结论：细胞的衰老是由端粒驱动的。体外培养的细胞端粒的长度随细胞逐代相传而缩短，丢失到一定程度便失去对染色体的保护作用。细胞随之发生衰老和死亡。,.,可把端粒看成一面钟，端粒的长度是钟上的刻度，记载了细胞分裂的次数，称为“端粒钟”，或有丝分裂钟或“生命的时钟”，可通过测定端粒的长度预测细胞的寿命。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度并不随细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限的分裂能力，原因在于端粒酶的存在。,.,端粒酶与肿瘤,人体内除了生殖细胞和少数一些体细胞如淋巴细胞等细胞外，绝大多数体细胞中无法检测到端粒酶的活性，而在多数肿瘤细胞中能检测到端粒酶的活性。肿瘤的端粒长度很短，其继续缩短导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，维持肿瘤的继续分裂、增殖。端粒酶的表达可能是肿瘤形成和发展的共同途径。,.,端粒酶与恶性肿瘤之间有相关性使之在肿瘤的诊断和治疗上有望成为新的靶目标。可以通过各种途径抑制端粒酶的活性有效抑制大多数肿瘤的生长，而对正常细胞没有影响。,.,第五节基因突变与DNA的损伤和修复,作为一种能决定生命状态存在和延续的生物大分子，DNA在遗传过程中必需保持高度的精确性和完整性，而且这种性能是细胞中任何一种分子都无法与之相比的。尽管如此，在DNA复制过程中，仍难免会存在少量未被校正的差错。此外，DNA还会受到各种物理和化学因素的损伤。,.,这些差错和损伤如果不被修复，将会产生严重的细胞学后果，因为DNA分子本身是无法替代的，一个细胞通常只有1-2套基因组DNA，而不像蛋白质和RNA分子那样，能利用DNA中的遗传信息不断产生新的分子来替代受损伤的分子。,.,维护DNA遗传信息的稳定性对生物细胞来说是极其重要的。在漫长的生命进化过程中，生物体不仅演化出能纠正复制错误的“校正”系统，而且在细胞中形成了多种多样的DNA修复系统，能对各种DNA的损伤进行修复，恢复DNA正常的超螺旋结构，以保持每个世代遗传信息的稳定性。,.,极少数不能修复的DNA损伤将会导致基因的突变。突变是遗传物质发生了可遗传的改变，而这种改变可以发生在染色体水平和基因水平上。其中一部分突变将有利于物种的进化，而另一部分突变将导致细胞发生变异和死亡。,.,一.DNA的损伤,由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联、链的断裂、重组等。引起DNA损伤突变的因素如下,.,（一）自发因素1脱嘌呤和脱嘧啶在生理条件下，DNA分子通过自发水解经常发生脱嘧啶和脱嘌呤反应，使嘌呤碱和嘧啶碱从DNA分子的脱氧核糖-磷酸骨架上脱落下来。例如，在腺嘌呤和鸟嘌呤的N-9及脱氧核糖C-1之间的N-糖苷键常发生自发水解反应而断裂，从而失去嘌呤碱基，使该嘌呤碱基所编码的遗传信息丢失。,.,Lindahl估计，一个哺乳动物细胞在37条件下，20小时内通过自发水解可从DNA链上脱落约10000个嘌呤碱和500个嘧啶碱。在一个长寿命的非复制的哺乳动物细胞（如人的神经细胞）的整个生活中自发脱嘌呤数约为108个嘌呤碱，它们占细胞DNA中总嘌呤数的3%。每个细胞每小时脱去的嘌呤碱和嘧啶碱分别约为580个和29个。自发脱嘧啶反应一般频率很低。,.,2碱基的脱氨基作用碱基中的胞嘧啶（C）、腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）都含有环外氨基，氨基有时会自发脱落，从而使胞嘧啶变为尿嘧啶（U），腺嘌呤变为次黄嘌呤（I）,鸟嘌呤变为黄嘌呤（X）。这些脱氨基产物的配对性质与原来的碱基不同，即U与A配对，I和X均与C配对。而且DNA复制时，它们将会在子链中产生错误而导致DNA损伤。,.,例如，胞嘧啶自发水解脱氨变成尿嘧啶后，如果未被修复，产生的尿嘧啶会在接下来的复制中与腺嘌呤配对，从而产生点突变。DNA分子以这种方式产生尿嘧啶很可能就是DNA含有胸腺嘧啶而不是尿嘧啶的原因。因为这样可使DNA分子中发现的任何尿嘧啶，均可被一种称为尿嘧啶DNA糖化酶所切除，并由胞嘧啶所替代。胞嘧啶自发脱氨基成为尿嘧啶的频率估计约为每小时每个细胞次，即每天每个细胞次。,.,3碱基的互变异构DNA中的四个碱基都可能自发地使氢原子改变位置而产生互变异构体，从而使碱基的配对形式发生改变。如腺嘌呤的稀有互变异构体与胞嘧啶配对，胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤配对。当DNA复制时，如果模板链上存在着这样形式的互变异构体，在子链上就可以产生错误，造成DNA损伤。,.,例如稀有碱基腺嘌呤和胞嘧啶，或稀有碱基胸腺嘧啶与鸟嘌呤形成氢键，便可导致下一世代中G-C配对取代A-T配对.?4细胞正常代谢产物对DNA的损伤在所有需氧细胞中，细胞呼吸作用产生的副产物超氧阴离子（O2-）和H2O2非常活跃.由于这些超氧化物、氢过氧化物及羟基自由基（OH）等活性氧的存在，导致DNA在正常条件下发生氧化损伤。,.,这些自由基可在许多位点上攻击DNA，产生一系列特性变化了的氧化产物，如8-氧化鸟嘌呤、2-氧化腺嘌呤和5-羟甲基尿嘧啶等。电离辐射引起水分解所产生的羟基自由基，会提高这些氧化产物的水平。氧自由基对DNA的损伤是由金属离子，尤其是铁离子所介导的，因此，螯合剂、自由基清除剂、超氧化物歧化酶、二氧化物酶和过氧化物酶活力的增强，都能降低氧自由基的毒性。,.,此外，葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，可能还有其他的糖分子也能和DNA反应，产生明显的结构和生物学改变，这些改变的累积可导致细胞老化。除上述自发性损伤外，DNA分子还会自发产生单链断裂、链间交联和形成一些甲基加合物等。,.,（二）物理因素由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。物理的诱变损伤因素可分为电离辐射和非电离辐射两大类。,.,电离辐射因素,电离辐射的诱变损伤因子主要是由Co60、Cs137发生的X射线和射线，由H3发生的射线，由P32、S35发生的射线等.尽管各类射线能量以及对生物组织和细胞的穿透能力各不相同，但离子射线导致基因