课题3　分解纤维素的微生物的分离

JLSSYBYH,纤维素与纤维素酶,1.纤维素,性质：纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物.是含量最丰富的多糖类物质。,一、基础知识,分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸杆也富含纤维素。,举例：溶于水的羧甲基纤维素钠（CMC-A）不溶于水的微晶纤维素,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中能产生纤维素酶的微生物所利用，不会大量积累。,在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。,人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精，用纤维素酶处理服装面料等。,2.纤维素酶纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,取二支20mL的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,提示：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？,1.筛选方法：刚果红染色法,2.筛选原理：刚果红(CR)能与纤维素（这样的多糖）形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,（二）纤维素分解菌的筛选,刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,方法一：先，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,配置CR溶液，灭菌按照1mlCR/200ml培养基比例混匀倒平板培养出现透明圈,培养基上长出菌落覆盖CR（10-15min）倒掉CR加入Nacl溶液（15min，漂洗的作用)倒掉Nacl溶液出现透明圈,3.步骤,这两种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,选择培养基成分分析,3.筛选过程用到的两种培养基(学案30页）（选择培养基和鉴别培养基）,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。,C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),二、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选透明菌落,什么样的环境取样?,培养的目的?选择培养基的特点?,可做进一步鉴定（发酵产纤维素酶）,鉴别培养基的特点?如何鉴别?,富含纤维素（腐殖质）,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；,刚果红染色法,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,举例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,人为设置环境：将滤纸埋在土壤中，能使纤维素分解菌相对集中。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中（30天）。,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有30ml选择培养基（液）的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养12天，直至培养液变混浊。也可重复选择培养。,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101106倍。,3.梯度稀释,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,（1）制备鉴别培养基(刚果红染色）,（2）涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C370C培养，可获得纯化培养。,5、挑选透明圈的菌落,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。2.分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_发酵和_发酵。纤维素酶测定方法是对纤