番茄中果胶酶活力的测定

实验三 番茄中果胶酶活力的测定一、实验原理番茄中的果胶酶系相当复杂，它主要包括聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶酯酶（PE）两类。聚半乳糖醛酸酶能催化果胶降解，导致果胶溶液粘度下降。因此，可通过测定酶催化反应体系粘度下降的速度来测定它的活力，果胶酯酶能催化果胶分子中半乳糖醛酸单位上的酯键水解，产生游离的羧基和甲醇，导致果胶溶液的pH下降，因此可以用pHstat法测定它的活力。2、 试剂和仪器试剂：20%氯化钠溶液、0.05mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液 pH4.5（）、1%果胶溶液 pH4.5、0.5mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液 pH4.5（）、1mol/L 氯化钠溶液、0.1mol/L 氢氧化钠溶液（准确标定）、0.05mol/L 氢氧化钠溶液仪器：组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、秒表、常规玻璃仪器、奥氏粘度计、pH计3、 实验步骤1、 酶液的制备300g番茄 + 100mL20%氯化钠溶液 匀浆 离心（4,10000rpm，20min） 沉淀 上层清液 抽滤，量取清液体积 沉淀 酶液 按516g硫酸铵/L酶液（80%的硫酸铵饱和度） 缓慢加入研细的硫酸铵粉末 离心（40,10000rpm，20min） 上层清液 沉淀 溶于约10mL0.05mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液 酶液 在0.05mol/L醋酸缓冲液中透析（MWCO12000） 透析物 离心（40,10000rpm，20min） 沉淀 部分纯化的果胶酶溶液2、 PG活力的测定测定30下水的流动时间，3次平行之间相差应小于0.2秒。将50mL 1%果胶溶液（pH4.5）、20mL0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液和30mL去离子水置于250mL具塞三角瓶中并充分混和。将三角瓶置于30恒温水浴中保温。待温度达到平衡后，测定该混和液的流动时间，计为果胶空白。移取上述混合溶液20mL到50mL三角瓶中，加入1mL已在同一温度下恒温的酶液，立即混合，开始记录时间。移取10mL反应混和物到已恒温的奥氏粘度计中，在不同的时间间隔连续测定混合体系的流动时间。以流动时间对测定时间作图，并外推求出零点。从直线的斜率计算流动时间降低的速度，以每秒钟流动时间降低的百分数表示果胶酶的活力。3、 PE活力的测定测定果胶酯酶的装置如图所示。在反应器中加入10mL 1%果胶溶液，2.5mL 1 mol/L氯化钠溶液和10mL去离子水，将恒温水浴温度调节到30，采用0.1mol/L NaOH溶液调节体系pH到7.5，然后加入0.5mL酶液，开始计时。不断地加入0.1mol/L NaOH溶液，使溶液的pH保持在7.50.3，记录不同反应时间下碱液的累积消耗量。每分钟释放出一个微克当量的羟基定义为1个果胶酯酶活力单位。这里所说的“微克当量的羟基”实际上就是“氢氧根的微克数”。作NaOH消耗量-反应时间曲线，由直线的斜率计算果胶酯酶活力。4、 数据记录与处理1、PG活力的测定空白第一次第二次第三次平均水空白（秒）43.0343.1842.8243.01果胶空白（秒）120.40120.28120.31120.33酶样品活力测定测定时间（秒）103.24205.74335.25442.61流动时间（秒）66.5954.6849.6946.32Fr3.2846.70411.27923.40校正测定时间（秒）136.535233.08360.095465.77由相对流动值Fr=（KPa-KH2O）/（T-KH2O），所以可以计算出不同测定时间下反应液的Fr值。以Fr值对校正的测定时间作图，作图如下可得斜率M为0.0581，所以加入的1mL酶液的活力=0.0581100=5.81U/mL2、PE活力的测定30时果胶酯酶活力测定数据如下：（C标准（NaOH）=0.05mol/L）时间（s）165997128碱管读数（mL）1.422.543.524.22NaOH消耗量（mol）71127176211NaOH消耗量时间曲线如下：由斜率为75.398，也就是说0.2mL的酶液作用1分钟所产生的羧基需要75.398mol的NaOH来中和，即需要75.39817=1281.766g的羟基来中和。由每分钟释放出一个微克当量的羟基定义为1个果胶酯酶活力单位，可知酶液中PE的活力为1281.766/0.2=6408.83U/mL。5、 讨论1、 聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶活力测定是在它们的最适 pH 下进行的。2、 实验中采用奥氏毛细管粘度计， 30时去离子水的流动时间应在 4045 秒为宜。从实验结果来看是符合要求的。3、测定聚半乳糖醛酸酶活力时，酶液浓度应控制在流动时间每分钟下降1s以内。当流动时间下降20%时即可停止实验。4、测定果胶酯酶活力时，pH范围一般可控制在7.50.3。一是为了水解反应顺利进行，二是为了促进酸碱中和能迅速