非标记生物物理技术在分子相互作用领域的应用

非标记生物物理技术在分子相互作用非标记生物物理技术在分子相互作用 领域的应用领域的应用 通用电气医疗集团生命科学部 应用工程师 韩佩韦 博士Peiwei.han 400-810-9118 2014.6.30 2 / GE Title or job number / 2014-06-30 内内容简介容简介 一一、非标记、非标记生物物理技生物物理技术概述术概述 二二、BiacoreBiacore原原理及在蛋理及在蛋白互白互作和药筛中作和药筛中的应用的应用 三三、微量热技、微量热技术简术简介介 四四、Q ; 14 / GE Title or job number / 2014-06-30 传感图（解离阶段）传感图（解离阶段） buffer sample injection buffer Buffer flow baseline -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 100 200 300 400 500 Time (s) Response Units (RU) 3 报告点报告点 ( (时间时间, , 响应值响应值) ) 3. 3. 仪器停止进样并切换至缓冲液，实时跟踪药物仪器停止进样并切换至缓冲液，实时跟踪药物- -靶标靶标 复合物的解离过程，反映稳定性复合物的解离过程，反映稳定性; ; 15 / GE Title or job number / 2014-06-30 Biacore Biacore 系统系统 基于芯片表面的质量浓度变化 Time Response 结合的特异性结合的特异性 选择性怎么样？ 活性含量测定活性含量测定 特异性的结合活性特异性的结合活性 存在多少活性的成份？ 亲和力亲和力 动力学动力学 分子间结合有多紧密？ 分子间结合的速率有多快？复合物有多稳定？ 16 / GE Title or job number / 2014-06-30 BiacoreBiacoreTM TM 系统组成 系统组成 传感芯片传感芯片 精准的流路控制系统精准的流路控制系统 典型传感图典型传感图 丰丰富的配套试剂盒产品富的配套试剂盒产品 智能智能控制和分析软件控制和分析软件 表面等离子共振表面等离子共振(SPR)(SPR)检测器检测器 17 / GE Title or job number / 2014-06-30 SPRSPR反应发生在传感芯片（反应发生在传感芯片（Sensor chipSensor chip）上）上 Dextran matrix Glass Gold layer Sensor Chip CM5 series 芯片由玻璃层、金膜、防吸附层以及衍生物几部分组成芯片由玻璃层、金膜、防吸附层以及衍生物几部分组成 18 / GE Title or job number / 2014-06-30 完善的配套试剂盒与芯片完善的配套试剂盒与芯片 1111种芯片（适用于不同的研究目的）种芯片（适用于不同的研究目的） - CM5CM5, CM4, CM3, CM4, CM3 芯片芯片 蛋白、肽段、小分子等蛋白、肽段、小分子等 SASA芯片芯片 生物生物素标记的分子，如核酸、糖类等素标记的分子，如核酸、糖类等 Biotin Biotin CAPCAP芯片（芯片（new!new!）可逆性生物素捕获芯片可逆性生物素捕获芯片 NTANTA芯片芯片 HisHis重组蛋白重组蛋白 L1L1 芯片芯片 模拟脂质双分子层环境模拟脂质双分子层环境 HPAHPA芯片芯片 实实现膜系统相关的互作分析现膜系统相关的互作分析 C1C1芯片芯片 研研究细胞、病毒等大颗粒分子究细胞、病毒等大颗粒分子 AuAu裸金芯片裸金芯片 客户定制表面（材料、高分子等）客户定制表面（材料、高分子等） CM7CM7（new!new!） 小分子化合物研究小分子化合物研究 3030余种优化的试剂盒及缓冲液余种优化的试剂盒及缓冲液 氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒；氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒； GSTGST捕获试剂盒捕获试剂盒 GSTGST重组蛋白分析；重组蛋白分析； NTANTA捕获试剂盒（捕获试剂盒（new!new!） His His 重组蛋白分析；重组蛋白分析； CM7CM7 CM5CM5 CM4CM4 CM3CM3 C1C1 SASA NTANTA HPAHPA L1L1 AuAu 羧羧基衍生芯片基衍生芯片 其他衍生芯片其他衍生芯片 19 / GE Title or job number / 2014-06-30 药药物滞留时间取决于药物物滞留时间取决于药物- -靶点靶点复合物复合物解解离速离速率率 两种药物分子具有相同的快速清除速率（较短的两种药物分子具有相同的快速清除速率（较短的 plasma tplasma t ) ) 1 2 Time (h) 1 M 0 M 药物药物浓度浓度 100 % 100 % 位位点被药物占据点被药物占据 92 % 92 % 位点被药物占据位点被药物占据 87 % 87 % 位点仍被药物占据位点仍被药物占据 0 % 0 % 位位点被药物占据点被药物占据 因此，亲和力更高并不意味着药效一定更好因此，亲和力更高并不意味着药效一定更好! ! 10-3 = 19 minutes 10-4 = 2 hours 10-5 = 19 hours 10-6 = 8 days koff (s-1) t KD = 100 pM kon = 107 (M-1S-1) koff = 10-3 (S-1) KD = 10 nM kon = 103 (M-1S-1) koff = 10-5 (S-1) Residence time - 20 / GE Title or job number / 2014-06-30 BiacoreBiacore相相互作用分析技术的特点互作用分析技术的特点 1. 1.实实时监控（时监控（RealReal- -time Monitoringtime Monitoring） 反映分子动态的相互作用和互作全过程；信息丰富（动力学、热力学等）反映分子动态的相互作用和互作全过程；信息丰富（动力学、热力学等） 2. 2.无无需标记（需标记（LabelLabel- -FreeFree） 避免因标记探针而影响生物分子的天然构象；避免因标记探针而影响生物分子的天然构象； 不受样品、背景物质中的颜色、荧光、散射、紫外吸收等因素的干扰不受样品、背景物质中的颜色、荧光、散射、紫外吸收等因素的干扰 3. 3.强亲和力、弱亲和力及瞬间相互作用都可以检测强亲和力、弱亲和力及瞬间相互作用都可以检测 BiacoreBiacore可可以检测以检测mMmM级（弱亲和力）至级（弱亲和力）至pMpM级（强亲和力）的相互作用级（强亲和力）的相互作用 4. 4. 自动化高、省时省力（自动化高、省时省力（FriendlyFriendly，AutomaticAutomatic） 人性化向导式软件、全自动进样分析、几次按键完成全面分析人性化向导式软件、全自动进样分析、几次按键完成全面分析 5. 5. 完全活性的互作分析完全活性的互作分析 只有具有结合活性的蛋白在只有具有结合活性的蛋白在BiacoreBiacore上才有上才有SPRSPR信号信号 21 / GE Title or job number / 2014-06-30 回收回收 MALDIMALDI- -TOFTOF- -TOFTOF鉴定鉴定 回收回收 垂钓垂钓 点靶点靶 LCLC- -MS/MSMS/MS模式模式 独独特的配体特的配体垂钓垂钓及回收功能及回收功能 (SPR-MS 178(11):7467-72 Copyright 2007 The American Association of Immunologists, Inc. 85 / GE Title or job number / 2014-06-30 在高浓度或长时间用药的情况下，血液中可能存在过量的药物分子；在高浓度或长时间用药的情况下，血液中可能存在过量的药物分子； 实际检测中，实际检测中，ADAADA至少需要有一个结合位点与固定于芯片的药物结合；至少需要有一个结合位点与固定于芯片的药物结合； 过量的药物分子会与过量的药物分子会与ADAADA结合从而抑制结合从而抑制ADAADA与芯片与芯片/ /板上药物的结合，导致假阴性结果；板上药物的结合，导致假阴性结果； 因此，在分析前需要打破药物因此，在分析前需要打破药物- -抗体复合体从而释放出抗体复合体从而释放出ADAADA； 传统传统桥桥联联ELISAELISA 因因分离分离的中和的中和/ /分析步骤可能导致药物分析步骤可能导致药物- -抗体复合体的再次形成抗体复合体的再次形成 芯芯片表面有药物蛋白，如抗体片表面有药物蛋白，如抗体 蛋白药物浓度逐渐增加 挑战挑战二二：在药物干扰下测定：在药物干扰下测定ADAADA 86 / GE Title or job number / 2014-06-30 BiacoreBiacore方法在方法在药药物干扰下测定物干扰下测定ADAADA的解决方案的解决方案 加入血清加入血清 仪器自动仪器自动 加酸酸解加酸酸解 pH 2-3 进样及检测流程进样及检测流程 中和缓冲液中和缓冲液 酸解后的样品酸解后的样品 流动池流动池 检测到结合信号 在在BiacoreBiacore系统中，酸解后的中和与分析步骤几乎是在同一时间完系统中，酸解后的中和与分析步骤几乎是在同一时间完 成的，因此，有效的避免了药物分子成的，因此，有效的避免了药物分子- -抗体复合物的再次形成。抗体复合物的再次形成。 87 / GE Title or job number / 2014-06-30 挑战三：挑战三：IgG4IgG4型型ADAADA检检测及中和性抗体的检测测及中和性抗体的检测 (CLB)(CLB) 根据根据FDAFDA要求，免疫原性检测应该能要求，免疫原性检测应该能 够检测到所有的够检测到所有的IgGIgG亚型。亚型。IgG4IgG4，一，一 种除了种除了IgG1IgG1外的重要外的重要ADAADA亚型，经常亚型，经常 自发的发生随机重组形成自发的发生随机重组形成BispecificBispecific ADAADA，这在桥联，这在桥联ELISAELISA方法无法检测到方法无法检测到 ，而基于直接检测（，而基于直接检测（Direct Binding Direct Binding AssayAssay）的）的 BiacoreBiacore SPRSPR方法可以。方法可以。 确认样品中的中和性抗体是确认样品中的中和性抗体是ADAADA表征表征 的一部分。中和性抗体对药物具有中的一部分。中和性抗体对药物具有中 和效应。传统方法应用和效应。传统方法应用BioassayBioassay方法方法 对中和抗体进行检测，但重复性欠佳对中和抗体进行检测，但重复性欠佳 。竞争性配体结合实验。竞争性配体结合实验(Competitive (Competitive Ligand Binding, CLBLigand Binding, CLB）常作为另一种）常作为另一种 可选的方式。可选的方式。CLBCLB也是欧盟草案中分析也是欧盟草案中分析 抗体药物的优选建议方案。抗体药物的优选建议方案。 88 / GE Title or job number / 2014-06-30 本节小结本节小结 SPR SPR 方方法分析法分析ADAADA含量符合含量符合FDAFDA和和欧盟欧盟官方灵敏度要求官方灵敏度要求 ，是，是FDAFDA和和欧欧盟盟分分析免疫原性的建议技术之一；析免疫原性的建议技术之一； SPRSPR方法方法较较桥联桥联ELISAELISA方法可以更早的检测到低亲和力方法可以更早的检测到低亲和力 ADAs ADAs （快结合（快结合/ /快解离快解离 ADAADA），以及难以被），以及难以被ELISAELISA检测检测 到的到的IgG4IgG4型的型的ADAADA； BiacoreBiacoreTM TM T200 T200 系统提供符合系统提供符合FDAFDA和欧盟官方免疫原性和欧盟官方免疫原性 测试要求的测试要求的全面全面硬件和软件支持。硬件和软件支持。 89 / GE Title or job number / 2014-06-30 BiacoreBiacore和和ITCITC可以快速获得高水平文章经常要求提可以快速获得高水平文章经常要求提供的非标供的非标 记分子互作证据的重要工具；记分子互作证据的重要工具； BiacoreBiacore的回收功的回收功能可用于发现未知能可用于发现未知的相互作用蛋白的相互作用蛋白、药物药物 活性成活性成分等分等重要的研究对象；重要的研究对象； BiacoreBiacore可无可无需纯需纯化的固定混合物的待研究分子，并结合分化的固定混合物的待