荧光定量PCR实验数据分析

荧光定量PCR实验数据分析与常见问题解决,技术支持黄志,内容,LifeTechnologies公司定量PCR仪产品概览荧光定量PCR实验数据分析荧光定量PCR实验常见问题的解决,AB荧光定量PCR仪的发展历史,1995世界上第一台定量PCR仪-7700型诞生1997推出面向医疗系统用户的5700型定量PCR仪2000推出7900型384孔定量PCR仪2001推出7900型96孔定量PCR仪2001推出7000型96孔定量PCR仪2004获得定量PCR仪专利确立AB在业界内的领先地位2004第5代定量PCR仪73007500型诞生第6代定量PCR仪StepOne和StepOnePlus问世第7代定量PCR仪ViiA7发布最新荧光定量PCR仪QuantStudio12KFlex发布,AB荧光定量PCR仪家族,第一、二代77005700,第三、四代70007900,第五代73007500,第六代stepone/plus,第七代ViiA7,最新型QuantStudio,荧光定量PCR实验数据分析,荧光PCR实验结果的分析流程,查验扩增曲线,检查/调整基线,检查/调整阈值,检查NTC,检查阳性对照,检查阴性对照,分析样品数据,基线与阈值线的设置,一般情况下选择软件默认的“自动设置”；特殊情况下或必要时，可以手动设置；手动设置的原则请查询“DataAnalysisontheABIPRISM7700SequenceDetectionSystem:SettingBaselinesandThresholds:Guide:RevA”，文件号：4370923。,基线的设定,系统背景信号，在扣除背景过程中影响扩增信号的数值，最终影响Ct值。默认自动分析，比如设定在“3-15”个循环。手动设置时要避开前期的荧光波动与后期的扩增信号。必要时可以独立设定制定样品的基线取值范围（V2.0）。,阈值线的设定,默认设定为同类扩增基线信号标准差的10倍，反映扩增信号具有统计学显著的意义。不同扩增子应当独立设定阈值线。手动设置在“指数扩增期”，避开前期的背景荧光波动与后期的非指数扩增及阴性对照最高点。对于绝对定量实验，阈值线设定在使得标准曲线的决定系数值（R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。对于无标准曲线的实验，阈值线设定在使得重复样品Ct值差异最小的位置。阈值线设定在保障灵敏度均为最佳的位置,实验结果的考评指标,定性实验：是否为显著的“S型”扩增曲线扩增曲线的“高度”-表示体现扩增性能的“强度”阳性对照的Ct值是否在“预期”的位置：过早污染或加样错误过晚存在抑制剂或扩增体系条件不佳阴性对照是否报告Ct值污染、探针特异性差、阈值线设定过低,绝对定量实验：标准曲线的斜率或扩增效率标准曲线的决定系数值：R2检测样品是否偏离标准曲线重复样品Ct值的标准差,绝对定量实验效果的评估,CT=klgX0+b,CT2CT1=（klgX02+b）（klgX01+b）,CT2CT1=k(lgX02lgX01),CT2CT1=klg(X02/X01),当扩增效率为100时，K=-3.32，若CT相差1，则两个样品的浓度差异为：,lg(X02/X01)=(CT2CT1)/k,当扩增效率为100时，K=-3.32，两个样品的浓度差异为10倍，则CT差异为：,CT值差与模板量差的关系,浓度增加1倍，CT值减小1个单位,浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位,荧光定量PCR实验常见问题,病原体核酸检测效果的主要影响因素,样品采集和储运,核酸抽提,核酸定量检测,采样部位、保存液、冻融,导致巨大差别的因素,导致一般差别的因素,交叉污染、抑制剂、病毒裂解,引物、探针设计/合成质量核酸的纯度和完整性预混液的质量,样品量,样品量、回收率,仪器、循环条件,实验污染反应试剂质量问题未正确密封而导致的试剂蒸发错误的荧光染料设置错误的反应程序设置使用错误的耗材荧光污染仪器硬件问题,导致异常实验数据的常见原因:,两种容易混淆的阴性对照,无模板的阴性对照在反应体系中不加入核酸模板，而以水为替代的对照目的：监控配制反应体系的试剂是否存在污染。阴性样品的对照在样品制备过程中，加入已知的阴性样品（或水），并将提取物作为模板加入反应体系，参与整个实验过程。目的：监控整个实验操作过程中是否存在污染。,故障排除时提供有用信息的软件界面,原始荧光组分曲线-v2.0,扩增曲线-v2.0,标准曲线-v2.0,原始多通道荧光信号-v2.0,原始多通道荧光信号-v2.0,质控报告-V2.0,理想的实验结果,案例1:是否存在扩增？,一些形状和正常的扩增曲线有区别的曲线，该如何判断呢？,正常的扩增曲线,平台期很低,可疑的扩增曲线,这些曲线都有典型的指数增长期，而且和其他的曲线平行（虽然比较短）。,如何判断它们是真正的扩增？,同时也具有特征性的三个增长阶段。,如何判断它们是真正的扩增？,可能是目标模板的浓度太低。通常如果模板的起始浓度太低,反应体系会形成大量的引物二聚体。大量引物二聚体的形成使得引物很快消耗完，从而造成扩增曲线的平台期很低。,是什么原因造成平台期很低?,案例2:是否存在扩增？,?,如何判断它们是否存在扩增？,首先，和同一反应中的其他扩增曲线相比，这些曲线的形状不相同。,同时，这些曲线都没有明显的指数增长期。,如何判断它们是否存在扩增？,其次，看Y轴的数值。这些“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2的范围内。,对数图,如何判断它们是否存在扩增？,最后，查阅线性图：曲线一直没有指数上升的趋势，提示不存在扩增。轻微的荧光增长可能来源于探针的降解。,如何判断它们是否存在扩增？,案例3:是否存在扩增？,右侧的曲线形状和扩增曲线很相似，但是曲线不光滑。,切换到线性图，可以看到曲线有一定的上升。,如何判断它们是否存在扩增？,分析,这些样品在反应的最后阶段才开始扩增，平台期很接近背景。这些样品的扩增曲线出现了指数扩增的区段虽然我们可以认为这些样品是临界阳性，但是对这些样品的定量结果都是不太准确的。形成这类曲线的原因可能是模板的质量差(RT/PCR抑制物;模板浓度低)，也可能是引物探针的设计问题。试剂原因如果使用的试剂背景信号太强，荧光的增长将会很小，导致扩增曲线的指数增长期会变得很短，或者没有。荧光信号差的试剂也会有同样的问题。,总结：遵循扩增曲线形态第一，Ct值第二的判读原则。,查看MultiComponentPlot：是否有正常的阳性扩增曲线查看扩增曲线的形状：是否有明显扩增阶段（指数增长期）?指数图下扩增曲线间是否平行