第三章基因工程的酶学基础PPT课件

.,1,第三章基因工程的酶学基础,.,2,一、限制性核酸内切酶二、连接酶三、DNA聚合酶四、其他酶,.,3,一、限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶,.,4,寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉,.,5,.,6,R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶,.,7,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,.,8,R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解,.,9,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶,限制性内切酶的分类,.,10,型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg+、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,.,11,型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。,.,12,型酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。,.,14,第一个字母：大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号,3.限制性核酸内切酶的命名原则：,例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶,.,15,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII,.,16,4限制酶的特性a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。,.,17,二、型酶,.,18,1.II型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,EcoRI的切割位点EcoRI的识别序列,.,19,5G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G33C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C5,EcoRI等产生的5粘性末端,退火4-7,EcoRI37,.,20,PstI等产生的3粘性末端,5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C5,5G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G33C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C5,PstI37,退火4-7,.,21,PvuII等产生的平头末端,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C5,5G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G33C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C5,PvuII37,.,22,2.核酸内切酶作用后的断裂方式（1）粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。,.,23,GGATCCCCTAGG,GCCTAGG,GATCCG,+,.,24,5-端突出粘性末端3-端突出,5AATTC3,53ACGTC,.,25,（2）平末端两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。,.,26,Hind,GTCGACCAGCTG,GTCCAG,GACCTG,+,.,27,.,28,3同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。,Example:限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中有一个5-甲基胞嘧啶时Hpa不能进行切割，而Msp可以。,.,29,4同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。,.,30,.,31,5限制片断的末端连接作用（）分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。,.,32,（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子,.,33,6.II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件,1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1g标准DNA所需的酶量,.,34,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHISmaI5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,II型核酸内切酶的多酶联合酶解：,5GCTACATGGATTCCCGGGTTCGCAT33CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT33CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,.,35,II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,.,36,6影响核酸内切酶活性的因素：（）DNA的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTTA、SDS、NaCl等DNase的污染(Mg+)a.增加核酸内切限制酶的用量；b.扩大酶催化反应的体系（稀释）；c.延长酶催化反应的保温时间。d.加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度,.,37,（2）DNA的甲基化程度大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,.,38,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。EcoRI在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATTPyPy3或者5AATT3,（3）核酸内切酶的缓冲液性质,嘧啶碱基T/C,嘌呤碱基A/G,.,39,（4）酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度37度（5）DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍,.,40,7核酸内切限制酶标准的缓冲液（1）.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变（2）.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH7.4）（3）.-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性（4）.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性,.,41,8核酸内切限制酶对DNA的消化作用（1）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用（2）核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平,.,42,（3）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-多（基因文库）,.,43,1连接酶2体外连接,1连接酶2体外连接,.,44,1.1连接酶的作用机理能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（OH）和5-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,.,45,.,46,.,47,酶AMP（腺苷磷酸）磷酸酰胺键,DNA的腺苷酸复合物3-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键,连接酶的作用机理,此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键,（赖氨酸残基）,.,48,1.2连接酶的来源.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的.T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的DNA连接酶NAD+T4DNA连接酶ATP,.,49,连接酶（DNAligase）该酶常从噬菌体的受体细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。,.,50,.,51,1.3影响连接酶作用的因素（1）反应温度：连接缺口的温度：37度连接粘性末端的最佳温度：415度（2）连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10mol1mmol/L之间（3）提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）,.,52,2.体外连接,.,53,体外连接的三种方式a.用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断b.用T4DNA连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA连接酶连接。c.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接,.,54,2.1粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连，对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3-OH和5-OH的缺口。,.,55,.,56,.,57,2.2平末端DNA片断的连接（1）T4DNA连接酶（2)用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,.,58,同聚物加尾法,用5末端特异的核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾巴1040个碱基,.,59,同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获得插入片断进行进一步的研究。,.,60,衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点,HpaIIHpaII,BamHI或Sau3A,.,61,衔接物（linker）：是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。,.,62,衔接物连接法,.,63,双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。,.,64,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入SalI衔接物,SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI,.,65,在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。,.,66,（）DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。,.,67,.,68,DNA接头连接法,.,69,（）热稳定的连接从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。可明显的降低形成非特异性连接产物的几率，在85度下具有酶活性。重复升温94度之后仍具有酶活性。,.,70,寡核苷酸连接测定（oligonucletideligationassay,OLA）用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。探针长度是2025bp连接酶链式反应（lingasechainreaction,LCR）连接扩增反应（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物。,.,71,寡核苷酸连接测定AGTGACCTTCACTGGAAGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGAAGTGACCTACCTAGTGACCTACCT,待扩增的DNA片断,P,P,B,B,D,D,地高辛配基,生物素,磷酸,B,B,B,B,D,D,P,P,阳性信号,无信号,链霉抗生素蛋白,由于碱基错配不能形成磷酸二酯键,检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性,碱性磷酸酶,碱性磷酸酶底物,.,72,LCR：ligasechainreaction，连接酶链式反应。,样品DNA、探针(4)94度变性、NAD,55度退火,.,73,三、DNA聚合酶,.,74,常用的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶等。,.,75,共同点：把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。,.,76,1.大肠杆菌DNA聚合酶DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol）、Pol和Pol的主要功能参与DNA的合成；Pol的功能同DNA的复制有关；Pol同DNA分子克隆的关系最为密切。,.,77,1.1大肠杆菌DNA聚合酶：1957年，美国的生物学家A.Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶。由pol基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109103dal。DNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的35的外切酶活性和53的聚合酶活性，另一个具有全部53的外切酶活性。,.,78,DNA聚合酶的酶活性：1.53的聚合酶活性；2.53的外切酶活性；3.35的外切酶活性（较低）。,.,79,1.2DNA聚合酶发挥作用的条件：1、底物：四种脱氧核苷5-三磷酸（dNTP）；2、Mg离子；3、带有3-OH游离基团的引物链；4、DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。,.,80,.,81,Pol,.,82,1.3DNA聚合酶53的核酸外切酶活性1、53的外切酶活性，所切割的DNA链必须是位于双螺旋的区段上；2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距5末端数个核苷酸远的一个键上发生；3、DNA的合成可以增强53的核酸外切酶活性；4、53核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及35的水解作用位点是分开的。,.,83,.,84,1.4DNA聚合酶的35核酸外切酶活性能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3-OH末端开始向5的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响：反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶的35核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被53的聚合酶活性所抑制。,.,85,.,86,1.5DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途：通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针DNA缺口转移（nicktranslation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶的53核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸，但pol不能在3-OH和5-P之间形成一个键，随着5一侧的核苷酸不断移去，3一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动,.,87,DNA杂交探针的制备典型的反应体系是。在25l总体积中含有1g纯化的特定DNA片断，并加入适量的Dnase、Pol、-32p-dNTPs和未标记的dNTPs。Dnase：造成DNA分子的断裂或缺口；Pol：进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。,.,88,dNTP对Pol酶活性的影响在低浓度dNTPs的条件下，Pol具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，Pol则能够更有效的合成DNA。低浓度的32p-dNTPs（2mol/L）和高浓度的dNTPs（20mol/L）一般希望有30%左右的32p-dNTPs参入DNA链（Dnase数量）。,.,89,2.Klenow片断与DNA末端标记Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为761000dal的大片断分子。仍具有53的聚合酶活性和35的外切酶活性，失去了全酶的53外切酶活性。,.,90,2.1Klenow片断的主要用途：（1）、修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；（2）、标记DNA片断的末端；（3）、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；（4）、DNA序列的测定。,.,91,2.2DNA片断末端标记：具有3隐蔽末端的带标记得的DNA片断5GATCT33A5在反应物中加入Klenow聚合酶-32p-dGTP,一道温育后生成：5GATCT3332pGA5或是同时加入-32p-dATPdGTP5GATCT3332pAGA5,.,92,DNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小DNA片断都得到了同等程度的标记。不能够有效的标记带有5突出末端的DNA分子,.,93,3.T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断1）从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有53的聚合酶活性和35的外切酶活性。2）在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按35的方向从3-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。3）在反应过程中，通过T4DNA聚合作用，反应物中的-32p-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。,.,94,.,95,取代合成法优于缺口转移法：（1）、不会出现发夹结构而缺口转移制备的探针会出现这种结构；（2）、应用适宜的核酸内切限制酶切割，便可很容易的变成特定序列的探针。,.,96,具EcoR1位点的DNA分子,对DNA分子3端有控制的降解,合成作用产生选择性标记,T4DNA聚合酶的取代合成法标记DNA断末端及制备链的特异探针,.,97,、反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成DNA。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。,具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5突出末端的DNA片断作末端标记。,.,98,.,99,.,100,合成cDNA的主要步骤：（1）、应用poly(A)mRNA为模板，以1218个碱基长的oligo(dT)片断作为引物，加入反转录酶，合成出cDNA第一链;（2）、用碱水解法除去mRNA模板，单链cDNA能自我折叠形成一种发夹结构，作第二链的引物，用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成；（3）、用S核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。（4）、通过同聚物或合成的衔接物，使DNA分子克隆到适当的载体分子上。,.,101,.,102,5.T7DNA聚