课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.pptx

,专题2微生物的培养与应用,2.2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,尿素分子的立体结构,CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3,脲酶,两个主要目的：(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,看视频：思考：1：怎样筛选菌株2：怎样统计菌落数目3：对实验基本原则的把握,一、研究思路,美国黄石国家公园的一个热泉,探究一：筛选菌株,水生耐热细菌Taq(Thermusaquaticus)耐高温的TaqDNA聚合酶美国微生物学科布鲁克1966年发现耐热细菌,1、实验室微生物的筛选原理（P21）,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。,探究一：筛选菌株,一、研究思路,加入青霉素的培养基细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物,P22:2、选择培养基,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。,探究一：筛选菌株,在培养基中加入可筛选金黄色葡萄球菌培养基中缺乏氮源可分离培养基中石油是唯一碳源可分离培养基中尿素是唯一氮源可分离在高温环境中可分离,高浓度食盐,自身固氮菌,P22:培养基配方,1.在此培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？,碳源是葡萄糖，氮源是尿素,2.分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，又是如何进行选择的？,有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。,（即：微生物计数）,1、显微镜直接计数法,1mm,探究二：怎样统计菌落数目,（计数板）,优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：1.难以计数微小量多的细菌。2.不能区分死菌与活菌,2间接计数法：最常用稀释涂布平板计数法。,统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,平板菌落数统计注意事项,1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；3、菌落数目过多时，可以合理采用样方法。,统计的菌落往往比活菌的实际数目。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,注意：,低,某班级菌落数统计表格,平板,组别,恰当的稀释度、正确的涂布操作是成功地统计菌落数目的关键。,（取样0.1mL,稀释倍数106）,2.间接计数（活菌计数法）,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(m)，M代表稀释倍数。,计算公式：,每克样品中的菌落数(CV)M,【例1】某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL）（）A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,【解析】稀释倍数为106，0.1mL稀释液的菌落数的平均值为234，则每毫升样品中菌落数就为234/0.1106=2.34109。,B,以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。,P26旁栏：滤膜法,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.第二位同学在该深度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板菌落数的平均值163作为统计结果。,P22：实例2：,探究三：实验基本原则的把握,你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,?,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。,因此，这两位同学的实验需要改进，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,说明设置重复组的重要性。,在做本课题的实验时，A同学从对应106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。,P22：实例3,但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。你能通过设置对照，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。一种方案：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,另一种方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,（总结）实验基本原则,1、平行重复原则,2、对照原则,3、单一变量原则,一、研究思路,实验名称：实验原理：实验目的：材料用具：方法步骤：1、分组编号2、处理（遵循实验设计的基本原则）对照原则、单一变量原则（等量原则）科学性原则、平行重复原则可行性原则3、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验结果的分析与评价：实验结论：,设计时请利用P23-P24的三个资料,能力提高：动手动脑设计,实验设计,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,资料一.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,实验设计,资料二.样品的稀释,将样品液稀释，选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30-300之间，适于计数的平板。,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。,实验设计,制备5个牛肉膏蛋白胨培养基15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。,实验设计,制备培养基,培养温度：培养时间：观察记录时间菌落特征,实验步骤,资料三：微生物的培养与观察,将涂布好的培养皿放在30下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，(P26：或在选择培养基上加入酚红指示剂）观察能否变红。,一无菌操作1.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,P25操作提示,二做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三制订计划,实验名称：实验原理：实验目的：材料用具：方法步骤：1、分组编号2、处理（遵循实验设计的基本原则）对照原则、单一变量原则（等量原则）科学性原则、平行重复原则可行性原则3、观察记录（设计观察记录表）实验预期：实验结果的分析与评价：实验结论：,设计时请利用P23-P24的三个资料,能力提高：动手动脑设计,实验设计,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,练一练,2.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（）A.比实际值高B.比实际值低C.和实际值一致D.比实际值可能高也可能低,3；下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、琼脂、水B.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水C.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、尿素、琼脂、水D.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、