微生物基础培训教材.pptx

微生物培训教材,主要内容,主要内容,1微生物基础知识,1.1微生物定义微生物(microorganism)是指存在于自然界的一大群形体微小、结构简单、进化低级、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百倍、数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。包括病毒、细菌、真菌、原生动物和某些藻类。,1.1微生物概述,细菌：是一类细胞细而短（细胞直径约0.5m，长度约0.55m）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。霉菌：霉菌是形成分枝菌丝的真菌的统称，构成霉菌体的基本单位称为菌丝，呈长管状，宽度210微米，可不断自前端生长并分枝。无隔或有隔，具1至多个细胞核。酵母菌：子囊菌、担子菌等几科单细胞真菌的通称。可用于酿造生产，有的为致病菌。菌落总数（aerobicplatecount）：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。菌落总数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。,1.1微生物概述,细菌,霉菌,酵母菌,菌落单位,菌落形成单位-cfu(colony-formingunits)由单个菌细胞或几个同种菌细胞在培养基上长成肉眼可见的菌落，每个菌落就是1cfu。,1.1微生物概述,1.1微生物概述,抑菌：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。防腐：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。使用同一种化学药品在低浓度时为防腐剂，在高浓度时为消毒剂。无菌：不存在活菌。灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。比消毒要求高，它杀灭了包括细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。,1.1微生物概述,培养基：人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的、多种营养物质的混合体。培养基中主要包含了微生物生长所需要的碳源、氮源、无机盐及微量元素。培养基按物理性状可分为：固体培养基半固体培养基液体培养基,1.1微生物概述,污染就是指当某物与不洁净的或腐坏物接触或混合在一起使该物变的不纯净或不适用时，即受污染。简单的说当一个产品中存在不需要的物质时，他即受到了污染污染的形式:尘埃粒子、微生物污染的载体:空气、水、表面、人。微生物的污染途径：自身污染：由于患者和员工自身携带微生物而污染。接触污染：由于和非无菌的用具、器械或人的接触而污染。空气污染：由于空气中所含微生物的沉降、附着或被吸入而污染。其他污染：由于其他因素（如昆虫）而污染。,1.1微生物概述,原核细胞和真核细胞的区别,原核微生物：核比较原始，没有核膜包围，不具核仁和典型的染色体，也没有固定形态。主要有细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体和立克次氏体等。,1.1微生物概述,真核微生物:是指细胞核有核包围,具有核仁,能进行有丝分裂,细胞质中有线粒体,内质网等细胞器的微生物。包括真菌、原生动物和藻类(蓝细菌除外)。目前，用于研究生产酶制剂的微生物大多数属于真菌，如木霉属，曲霉属，毛霉属，根霉属，青霉属，耙霉属，漆霉属等。其中研究最多的是木霉属，曲霉属，青霉属，根霉属及漆斑霉属。从近几年看，我国选育出的优良菌株大多为木霉属，少数为曲霉菌株。其优点是菌系丰富，但产酶低。而国外研究的工程菌恰与我们的相反。工程菌特点是菌系贫乏，但所产酶活力高。,洁净室等级划分,根据GMP的有关规定，洁净室分为四个等级，即100级、10，000级区、100，000级和300，000级，各级别的要求如下,微生物在自然界物质循环中充当分解者。人类生活在微生物的包围之中。其与人类的关系有利有弊。有害活动：疾病、腐败、霉变。共生活动：微生物能为宿主提供营养；宿主为微生物提供栖身的场所。自然界物质循环：微生物分解有机物、提高土壤的肥力、净化污水。工农业生产上：发酵产品、酶制剂、菌肥、生物农药、生物制品、饲料、抗菌素等。科研上：微生物是科研的掌上明珠。,微生物与人类的关系,微生物的益处,啤酒，葡萄酒的生产面包酵母的生产奶酪的生产醋的生产酸奶的生产维生素的生产类固醇的生产抗菌素、干扰素的生产,分解废物，循环利用帮助肠道中的食物消化除虫,微生物的害处,导致伤口感染导致胃肠不适引起感冒，咳嗽尿道感染败血症癌症脑脊膜炎破伤风,1.2微生物分类,微生物按其结构、化学组成及分化程度可分为:原核类:仅有原始核质，无核仁或核膜，细胞器很不完善。如细菌、放线菌、支原体、立克次氏体、衣原体、螺旋体真核类:细胞核的分化程度较高，有核膜、核仁和染色体，细胞器完整。如真菌（酵母菌和霉菌）、原生动物、藻类非细胞类:没有细胞结构，体积微小，能通过除菌过滤器。如病毒和朊病毒等,1.2微生物分类,具有细胞结构的微生物,没有细胞结构的微生物：病毒,原核微生物：（由原核细胞构成的）,真核微生物（由真核细胞构成的）,真菌显微藻类原生动物,细菌,草履虫,水绵,放线菌,微生物,立克次氏体蓝细菌支原体衣原体,1.3微生物特点,微生物的五大特点个体小,面积大：小于0.1mm，（大多数）肉眼不可见。分布广,种类多(10万多种)：自然界中到处都有，如水、空气、土壤等,土壤中的数量最多。代谢强，转化快：发酵乳糖的细菌在1小时内可分解其自重100010000倍的乳糖生长旺，繁殖快：微生物有惊人的繁殖速度，大多数微生物几十分钟内就可以繁殖一代适应性强，易变异：耐药性产生的原因,微生物的生长规律,微生物整个生长过程可以分为4个阶段：延滞期：细胞变大，细胞内RNA含量增高，培养基不丰富时延滞期较长。对数期：细胞分裂最快，代谢旺盛，生长速率由营养成分决定。稳定期：总体数量保持不变，开始产生代谢产物或开始形成芽孢。衰亡期：由于代谢毒素的积累，死亡数超过新生数。,最易处理期,微生物的显微形态,细菌的形态：球状、杆状、螺旋状。酵母菌的形态：球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等。霉菌的形态：丝状。病毒的形态：球状、卵圆形、砖形、杆状、蝌蚪状、丝状等。,2微生物的形态,2微生物的形态,基本形态球菌：按其排列方式又可分为单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌，葡萄球菌和链球菌。杆菌：细胞形态较复杂，有短杆状、棒杆状、梭状、月亮状、分枝状。螺旋状：可分为弧菌（螺旋不满一环）和螺菌（螺旋满26环，小的坚硬的螺旋状细菌）。此外，人们还发现星状和方形细菌。,2.1细菌的形态,2.1细菌的形态（球菌）,链球菌,单球菌,双球菌,四联球菌,八叠球菌,葡萄球菌,2.1细菌的形态（杆菌）,短杆菌,长杆菌,梭状芽孢杆菌,细菌在平板计数琼脂培养基,2.1细菌的形态（螺旋菌）,弧菌,螺旋菌,螺旋体,螺旋状的细菌称为螺旋菌。根据其弯曲情况分为：弧菌（vibrio)：螺旋不满一圈，菌体呈弧形或逗号形例：霍乱弧菌、逗号弧菌螺旋菌(spirillum)：螺旋满26环，螺旋状例：干酪螺菌螺旋体(spirochaeta)：旋转周数在6环以上，菌体柔软。例：梅毒密螺旋体,2.1细菌的形态,影响细菌形态的因素培养时间培养温度培养基成分浓度pH值,结核杆菌的正常形态,结核杆菌的异常形态,2.2酵母菌的形态,酵母菌是单细胞真核微生物，形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等，比细菌的单细胞个体要大得多，一般为15微米或520微米。酵母菌无鞭毛，不能游动。酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等。酵母菌的遗传物质组成：细胞核DNA，线粒体DNA，以及特殊的质粒DNA。,啤酒酵母,大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。,2.2酵母菌的形态,酵母菌在孟加拉红培养基上的形态,酵母菌与细菌的特征比较,2.2霉菌的形态,霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些。肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。,2.3霉菌的形态,霉菌菌落的特征：A、形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。B、菌落和培养基间的连接紧密，不易挑取，菌落正面与反面的颜色、构造，以及边缘与中心的颜色、构造常不一致。C、霉菌的菌丝有营养菌丝和气生菌丝的分化，而气生菌丝没有毛细管水，故它们的菌落必然与细菌或酵母菌的不同，较接近放线菌。,2.3霉菌的形态,霉菌的菌丝：构成霉菌营养体的基本单位是菌丝。菌丝是一种管状的细丝，把它放在显微镜下观察，很像一根透明胶管，它的直径一般为310微米，比细菌和放线菌的细胞约粗几倍到几十倍。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，就叫菌丝体。根据菌丝中是否存在隔膜，可把霉菌菌丝分成两种类型：无隔膜菌丝和有隔膜菌丝。,2.3霉菌的形态,生长在固体培养基上的霉菌菌丝可分为三部分：营养菌丝：深入的培养基内，吸收营养物质的菌丝；气生菌丝：营养菌丝向空中生长的菌丝；繁殖菌丝：部分气生菌丝发育到一定阶段，分化为繁殖菌丝，产生孢子。,孟加拉红培养基上的霉菌,2.4荧光显微镜下细菌、酵母菌、霉菌的形态区分,Triangle(三角形)=Bacteria(细菌)Rotundity(圆形)=Yeast(酵母菌)rectangle(长方形)=Mold(霉菌)Rhombus(菱形)=Moldspore(霉菌孢子)Hexagon(六边形)=Debris(异物),3显微镜的使用,普通光学显微镜通过普通光源的照明观察标本荧光显微镜利用一定波长的光，激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光,3.1显微镜的原理,荧光显微镜的特点,光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光具备相应的滤光镜系统。,什么是荧光？,物质吸收的短波光，发射出的长波光特点：荧光波长激发光波长荧光强度激发光强度有不同程度的衰减,透射式荧光显微镜落射式荧光显微镜,低倍镜高倍镜油镜,落射式荧光显微镜,荧光显微镜的种类,落射式荧光显微镜的主要部件,汞灯光源激发滤色镜,分色镜吸收滤色镜,荧光显微镜结构图,外加中级管或过滤器,平行光束,荧光显微镜的光路图,卤素灯,汞灯,聚光透镜,目镜,分色镜,激发滤色镜,相移片,聚光器,物镜,标本,相衬环,反光镜,聚光透镜,汞灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物镜,标本,落射式荧光显微镜原理图,3.2荧光显微镜的结构,各部件介绍,光源多采用200W的超高压汞灯作光源提供激发光（紫外和蓝紫光）滤色系统激发滤色镜：选择激发光的波长吸收滤色镜：透过荧光，阻挡杂光（完全阻挡激发光通过）,B透过,B阻挡,T%,T%,nm,分色镜反射激发光，透过荧光暗场聚光镜来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的物镜各种物镜均可应用，但最好使用消色差的物镜提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜目镜在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5和6.3,A透过,A反射,T%,各部件介绍,3.3荧光显微镜的使用说明及注意事项,3.3.1严格按照荧光显微镜厂家说明书要求进行操作，不要随意改变程序。3.3.2观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。3.3.3应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯515min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。,3.3.4载玻片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质，载玻片的厚度应在0.81.2mm之间，太厚可吸收较多的光，并且不能使激发光在标本平面上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无油渍或划痕。盖玻片厚度应在0.17mm左右。3.3.5防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。3.3.6选用效果最好的滤光片组。3.3.7检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射35min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过23h。,3.3荧光显微镜的使用说明及注意事项,3.3.8荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射（尤其是紫外线）易很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。3.3.9荧光显微镜光源寿命有限，启动高压汞灯后，不得在15min内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的寿命。标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。,3.3荧光显微镜的使用说明及注意事项,3.3.10标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。3.3.11若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，既可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。3.3.12荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”无或可见微弱荧光。“+”仅能见明确可见的荧光。“+”可见有明亮的荧光。“+”可见耀眼的荧光。,3.3荧光显微镜的使用说明及注意事项,3.3.13较长时间观察荧光标本时，一定要戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护。在未加入阻断滤光片前不要用眼直接观察，否则会损伤眼睛。3.3.14激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。3.3.15作油镜观察时，应用“无荧光油”。3.3.16荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。,3.3荧光显微镜的使用说明及注意事项,3.3.17荧光图像的记录方法:荧光显微镜所看到的荧光图像具有形态学特征和荧光的颜色、亮度,判断结果时，必须将二者结合起来综合判断记录结果：主观指标（即工作者目力观察）客观指标（细胞分光光度计、图像分析仪等）3.3.18显微镜使用后的整理观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作。清洁完毕，再下降镜筒，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，呈外“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩。,3.3荧光显微镜的使用说明及注意事项,3.4荧光显微镜的维护保养,3.4.1显微镜的光学部分(如镜头)，只能用特殊的专用擦镜头纸擦拭，不能乱用它物擦拭，擦时要顺着一个方向擦。如果擦拭不净，可蘸一点二甲苯继续擦。注意，决不能把镜头放到二甲苯中浸泡，这样会使镜头开胶，镜片脱落。3.4.2保持显微镜的干燥、清洁，避免灰尘、水及化学试剂的玷污。3.4.3应配备较好的防尘罩。3.4.4转换物镜镜头时，不要用手直接转动物镜镜头，只能转动转换器。,3.4.5不要随意转动粗细准焦螺旋。使用细准焦螺旋时，用力要轻，转动要慢，转不动时不要硬转。3.4.6不得任意拆卸显微镜上的零件，严禁随意拆卸物镜镜头，以免损伤转换器螺口，或螺口松动后使低高倍物镜转换时不同焦。3.4.7使用高倍物镜时，勿用粗准焦螺旋调节焦距，以免移动距离过大，损伤物镜和玻片。3.4.8用完后，必须检查物镜镜头上是否沾有水或试剂，如有则要擦拭干净，并且要把载物台擦拭干净，检查镜筒和镜臂上是否有污渍然后罩上防尘罩。,3.4荧光显微镜的维护保养,4消毒与灭菌,消毒：杀死物体上微生物的方法,并不一定能杀死所有微生物细菌的芽孢。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞，对热力干燥、辐射、化学消毒等理化因素有强大的抵抗力。灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。,共性：杀灭微生物以控制其污染和防止传染。区别：1、杀灭微生物完全性的差异。灭菌要求完全杀灭微生物，灭菌后的物品不应含有活的微生物。而消毒不完全杀灭微生物，只能杀灭一部分微生物即病原微生物。这是相对的。因为强效消毒剂在适宜条件下可能达到灭菌效果；在不适宜条件下灭菌，有不完全杀灭微生物的可能。2、方法上的差异：灭菌方法具有多样性，消毒常借助化学物质。3、效果检查的差异：灭菌效果用无菌检查法检测，而消毒效果以消毒剂的效价来评定。,4.1灭菌和消毒的区别,4.2灭菌的方法,1、热力灭菌2、气体灭菌3、辐射灭菌4、过滤灭菌,1、热力灭菌：主要是利用高温的致死作用，使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，而导致细胞死亡。热力灭菌分为干热灭菌与湿热灭菌(1)干热灭菌：灼烧与火焰灭菌、干烤灭菌灼烧主要用于接种工具灭菌，如接种针、接种环、刀、剪等在火焰上烧灼即可达到彻底灭菌。火焰灭菌是在无菌操作中，将试管口、玻璃瓶口、硅氟塑料塞等反复通过火焰数次，利用火焰对管口等进行灭菌，防止管口污染，作为无菌操作过程中的辅助灭菌手段。干烤灭菌是利用热辐射及干热空气进行灭菌,4.2灭菌的方法,(2)湿热灭菌法：通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法。包括：煮沸灭菌、流通蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌煮沸灭菌：加热使水至沸而杀灭细菌的方法。凡不适于高压蒸汽灭菌的物品可常压下在水中煮沸一段时间达到灭菌目的。流通蒸汽灭菌：常压下，用蒸笼、蒸锅等在100灭菌。仅可杀死细菌繁殖体，不能完全杀灭芽孢。高压蒸汽灭菌：通过加压提高蒸汽温度，穿透力强、温度高、灭菌效果最好。是最可靠最适用最广泛的灭菌方法，凡耐高温和潮湿的物品可应用本法灭菌。注意事项：完全排出高压灭菌器内的冷空气。（冷空气存在时，同一表压下所达到的温度值偏低，不符合规定的要求，灭菌就不彻底。,4.2灭菌的方法,2、气体灭菌：利用化学消毒剂形成的气体来杀灭微生物。臭氧杀菌消毒广泛存在于自然界中，雷雨过后的空气有一种清新的感觉，是因为空中放电产生臭氧，消灭了空气中的微生物，净化了空气。臭氧具有强烈的杀菌消毒作用。其杀菌消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧和单个氧分子，后者具有很强的活性，对细菌具有很强的氧化作用，臭氧氧化,4.2灭菌的方法,3、辐射灭菌（1）电离辐射:用引起电离的X射线、射线灭菌。电离辐射对微生物的致死作用，主要是细胞内生物化学的变化所致。辐射的药品、食品的安全问题：辐射灭菌用于药品或食品都应经过安全试验，完全有必要进行科学全面的评价，高剂量的辐射更应慎重。（2）电磁波辐射（包括紫外线波长190350nm、红外线波长0.771000m、微波波长11000mm）。,4.2灭菌的方法,（3）紫外线灭菌紫外线辐射的穿透力很弱，因此主要用于无菌室、某些工作区的空气灭菌、物体表面灭菌。实践工作中在无菌室无菌柜净化工作台工作室及车间安装紫外灯，一般仅起杀死空气中部分微生物的作用，而不能起到完全灭菌的作用。紫外线消毒方法验证中紫外灯需确认的参数主要有紫外线的波长、紫外线强度、灯管的寿命。紫外灯消毒的效果与紫外线强度、照射时间、温度与湿度等因素有关，还需通过验证来确定。,4.2灭菌的方法,注意事项：紫外线直射对眼、皮肤有损害。紫外线照射过程中产生臭氧，臭氧过多对眼及鼻腔有刺激，产生头晕、胸闷、血压降低，所以无菌室及净化工作台紫外线照射停止后，请稍等片刻，让臭氧消散，方可进行实验操作。4、过滤灭菌：以物理的方法除去介质中的微生物。常将空气或