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核移植技术和动物克隆，一、什么是动物克隆？ 动物克隆是在核移植过程中进行无性繁殖的技术。 发育初期的动物胚胎细胞或成年动物体细胞经过显微手术移植到去核的卵母细胞后，可以在适当条件下再发育成正常胚胎。 该胚胎被移植到接近生殖周期的母体，能发育成正常的动物个体。 经过核移植出生的动物，其遗传结构与核捐献者完全相同。 不经过这种有性生殖过程，通过核移植来生产与细胞核供体具有相同遗传结构的动物个体的技术被称为动物克隆。 核移植技术：核移植技术是指利用显微操作技术将一个细胞的核移植到另一个细胞，或者更换两个细胞的核(或者细胞质)，做出无性杂交生物新种的可能性的技术。 胚胎克隆：如果使用的核供体细胞来自多细胞阶段的胚胎，则称为胚胎克隆。 体细胞克隆：使用的核供体细胞使物体自动化，称为体细胞克隆。二、两栖类的核移植，1938年Spemann首先提出了将多细胞胚胎的各核移植到去除了核的卵母细胞，使它们在胚胎中生长的构想。 1952年，Briggs和King沿袭了Spemann的构想和实验技术，首次获得了两栖类青蛙胚胎细胞核移植的后代。 核供体在胚期胚胎细胞的实验中成功，核供体在肠胚期的中胚层和内胚层细胞的实验中失败，1958年至1962年英国剑桥大学的JohnGurdon和Machineer利用蟾蜍原肠内胚层核移植、培育的非洲1970年JohnGurdon用同样的方法用青蛙的脚鳍角质化细胞进行了移植核试验，青蛙卵生长为蝌蚪。 三、鱼类核移植，从1961年开始，为了童第周等以金鱼和鲫鱼为材料，成功地进行了鱼类不同亚科间的核移植，研究杂交核和纯种核的发育功能的差异，细胞质对核的影响，1979年，中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼进行了核移植。 他们将鲫鱼胚期细胞在385日连续59代培养后，将该培养细胞的核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。 到1980年4月，他们成功培育无性繁殖的幼鱼，其中一种发育正常。 1989年，童第周，牛满江将鲫鱼胚胎细胞核转移到鲤鱼脱核的未受精卵中，实现了异种间的核质杂交，成功无性繁殖。 四、哺乳类核移植，1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室以“亚无性繁殖”方式，培育了7只单亲小鼠。 使卵泡受精，在精、卵核融合前去除精核，放入装有适量细胞的松驰b溶液中。 该番处理的卵泡染色体复制后出现两个核，将该双核细胞放入正常培养液中培养。 鸡蛋中的双核细胞自动融合，细胞开始分裂。 将这个胚胎移植到母鼠的子宫里培育。 生产了7只单亲老鼠。 1981年，瑞士日内瓦大学与美国的杰克逊研究所合作，第一次成功进行了小鼠鸡蛋移动核试验。 他们把胚内细胞团细胞的核转移到核的受精卵中，使培养的核移植卵发育到胚期，并将该胚胎转移到同期妊娠小鼠的子宫内，最后产生雌雄一雄子小鼠，形成了能发育的个体。 五、核移植技术的一般操作程序、核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和配制、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎向代孕母畜(寄母)移动等程序。 1、核受体细胞的准备脱核卵母细胞常被用作核移植的受体细胞。这是因为卵母细胞的细胞质中含有特定的因子，所以可以重新排列移植核中包含的基因表达程序，使分化后的细胞返回发育过程的原点，与受精卵同样开始个体发育过程。 卵母细胞的由来有两种方式。 一种是用激素对雌细胞进行排列处理，从输卵管中飞出成熟的PS卵母细胞。 二是从屠宰场提取卵巢，提取滤泡中的卵丘卵母细胞复合体(COCs )，体外培养成熟后作为受体。 2、在核供体细胞的准备核移植操作中，核供体细胞首先必须是完全的二倍体，该细胞必须保持供体动物的完全基因组，其次，供体细胞核通过受体细胞质产生细胞分化过程的逆转，像刚受精的合子一样，重新开始了从受精到成长为正常的动物个体的全过程施主细胞主要有胚胎卵泡和体细胞两种。 此外，核供体细胞的来源是胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞。 3、核移植常用的核移植方法有细胞质内注射和透明带下注射两种。 细胞质内注射是用外径58m的注射针吸引施主核，并直接注射到卵母细胞质内的方法。 透明带下注射将供体核注射到透明带与卵母细胞之间的卵的间隙中，核移植后通过电刺激进行细胞融合。 4 .与卵母细胞激活相关的因素很多，通过受精激活卵母细胞和人工激活会引起卵母细胞的一系列反应。 这些反应对胚胎发育是必要的。 其活化原理是用电刺激、钙离子载体等方法使卵母细胞从MII期释放，转移到“受精”状态。 5、将重组胚的体内或体外培养融合和活化的重组胚移植到中间受体内或体外培养，观察重组胚的发育率。 羊、牛、猪核移植胚常采用体内培养方法获得桑椹胚和胚，羊和牛的重组胚在琼脂填埋后，在休情期母羊结扎的输卵管内培养，发育成桑椹胚和胚。 猪的核移植重组胚在同步受体母猪的输卵管内转移到体内培养7d，发育成胚。 大鼠、小鼠和兔核移植胚体外培养，多发育成桑椹胚或胚。 6、胚胎移植重组胚胎移植的受体母兽，皮毛颜色与供体品种不同，应选择繁殖性能强、体格稍大的本地品种，进行同期发情处理，用通常的方法移植到代孕母兽(寄母)子宫，发育到生育。 六、核移植技术的应用，1 .调制转基因克隆动物，进行生物药物生产2 .培育优良家畜种类，扩大优良品种群3 .扩大异种动物的克隆，拯救濒危动物4 .结合干细胞技术，开展治疗性克隆5 .利用核移植技术，研究生物学的基本问题。 七、克隆羊和体核移植，a .胚胎细胞株，b .胚胎成纤维细胞c .乳腺上皮细胞，d.PCRmicrosatellite，妊娠期6岁母羊(FinnDorset白品种母羊)的乳腺细胞作为核供体细胞，用饥饿法使其处于休眠状态，活化全基因。 第二阶段注射促性腺激素，促进母羊(SottishBlackface黑面母羊)排卵，2833小时取出未受精卵，尽快取出细胞核，连续1010.5天加入5天，G0期作为受体细胞。 第三阶段将乳腺细胞和无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下使乳腺细胞溶解于卵中，形成含有新遗传物质的卵泡。 第四阶段新卵泡被移植到羊结扎的输卵管，6天后发育成桑椹胚或胚(816个细胞)。 第五步是将这个早期胚胎转移到怀孕的母羊的子宫里，出生的多莉是6岁母羊的复制品，是白色。 为什么是划时代的工作：第一，解决了使施主细胞和核受体细胞(脱核卵泡)同步的方法。 第二，把体细胞作为核供体，解决了转基因问题。该成果的重要生物学意义第一，证明完全分化的动物体细胞还保留了原始胚胎细胞的遗传信息，经该技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性，形成了完整的个体。 第二，多莉是世界上第一只以成人哺乳动物体细胞为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。 它的成功暗示着我们可以进一步。 育成体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术，准确诱发核基因的遗传变化，或正确移植目的基因，利用选择技术，将产生满意变化的细胞正确筛选为核供体，生产基因克隆。 也就是说，我们能够按照人的意志改选、生产种子。 第三，在现代生物学领域，有先例通过有规律地控制基因可以解决更多问题。 多利羊的诞生和生长表明，利用克隆技术复制哺乳类的最后一次技术障碍已经突破，在理论上成为可能。 八、克隆技术存在的问题、理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重组(核内的全部或大部分基因关闭，细胞恢复完整性的过程)的机制尚不清楚，克隆动物是