黄曲霉毒素的测定(精)参考课件.ppt

黄曲霉毒素测定、黄曲霉毒素(Aflatoxins，简称AFT )是产毒株，如黄曲霉、寄生黄曲霉及温法斯等的代谢产物，是结构上类似的化合物。 目前，发现了17种黄曲霉毒素，根据波长365nm的紫外光呈不同颜色的荧光分为b、g两种，其中b的种类在氧化铝薄层板上用紫外光呈蓝色荧光，g的种类呈绿色荧光。 1、黄曲霉毒素是剧毒物质，其毒性高于氰化钾，是目前最强的化学致癌物质。 其中AFTB1的毒性和致癌性最强，食品中容许量各国被严格规定。 AFT主要污染了粮食油及其制品，如花生、花生油、玉米、米、棉籽等。 2、黄曲霉毒素容许量标准，食品品种容许量标准(ppb或10-6 )玉米、花生、花生油20玉米和花生制品20米，其他食用油10表装蛋糕，饼干，面包5婴儿代乳食品不能检测，3，本章要点，薄层黑1990年以来，被列为aoac (associationofofficialagriculturalchemists )的标准方法，该方法具有对黄曲霉毒素进行定性和定量分析的功能。 4、原理，本方法利用样品中的黄曲霉毒素B- 1，提取有机溶剂、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据薄层显示荧光的最低检测量测定黄曲霉毒素B- 1的含量。 薄层色谱法最低检出黄曲霉毒素Bt量为0.0004ug，最低检出浓度为5ug/Kg。 5，机器，小型粉碎机样筛电动振荡器玻璃浓缩器玻璃板5cm20cm，薄板板涂层器展开槽(25cm6cm4cm )紫外光灯100一125w，波长365nm过滤器，微型注射器(2)，6，试剂，氯仿，正己烷(沸程或者石油醚(沸点6090)、甲醇、苯、乙腈、无水醚或醚用无水硫酸钠脱水，丙酮。 以上试剂需要在试验前进行空白试验，如果不妨碍测定就可以使用，否则需要一个一个地重新蒸。 作为吸附剂的硅胶、薄层色谱用硅胶有各种规格。 使用最多的是加粘合剂石膏的硅胶，称为硅胶g，石膏的配合量为5-20%。 硅胶中可能含有铁盐和氯离子等杂质，这些被展开剂提取，对色谱结果产生一定的影响。 不含硅胶h粘合剂或其他添加剂(不从展开剂中提取杂质)。 配合硅胶HF254荧光指示剂，可用短波254纳米的紫外光观察荧光。 硅胶GF254包括石膏和荧光物质。8、黄曲霉毒素B1标准溶液、1、黄曲霉毒素B1标准贮藏液：准确称量11.2mgAFTB1标准品，加入乙腈2mL溶解后，用苯稀释成100mL，遮光，放入冰箱4保存。 该标准液浓度约为10ug/mL。 首先用紫外分光光度计测定其浓度，然后用苯乙腈混合液将该浓度调整到正确的10.0ug/mL。 350nm、AFTB在一乙腈(98 2 )混合液中的摩尔消光系数为19800 .9、2、黄曲霉毒素b标准使用液： I液(1.0ug/ml):mlaftb标准液(10.0ug/mL )取10mL容量瓶中，一乙酰苯液(0.2 ug/ml ) :取1mL液，按法定容积5mL。 液(0.04ug/mL ) :除液1mI。 按法定容量5mI。 的双曲馀弦值。 思考：制备黄曲霉毒素b的标准使用液时，为什么不直接制备，而需要用预备液稀释，10，次氯酸钠溶液，制备：取出100g漂浮白粉，加入500mL水，均匀搅拌。 另外，将80g工业用碳酸钠(na2c O3 H2O )溶解于500mL温水中。 合并、搅拌、澄清、过滤两种液体。 这个液体中含有25g/L次氯酸。 思考问题： 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？消毒用，把污染的玻璃器具用次氯酸钠溶液浸泡，能得到消毒效果。2、为什么次氯酸钠溶液起到消毒的作用？ 11、操作顺序，样品处理提取浓缩薄板制造点样展开定量，12、(1)样品处理，样品从大规模粗碎，连续用四分法缩小到0.5lkg后，全部粉碎。 粮食样品均通过20目筛，花生样品均通过10目筛，混合。 提取13，(2)，提取粉碎后的样品20.00g，装入带塞子的玉米瓶250mL中，加入正己烷或石油醚30mL和甲醇水100mL。 振荡30min，静置一会儿，用折叠式快速定性滤纸过滤到分液漏斗中，将下层的甲醇水溶液分离后，将甲醇水溶液放出到别的容器中。 将14、甲醇水溶液20.00mL放入另外125mL的分液漏斗中，加入氯仿20mL，振荡2min，静置层，发生乳化现象后，滴入甲醇促进层。 放出氯仿层，约10年前经过装有氯仿湿润的无水硫酸钠的定量低速滤纸，过滤到50mL的蒸发器中，再将5mL氯仿放入分液漏斗中，反复振荡提取，将氯仿层集中在蒸发器中过滤，最后用少量的氯仿清洗过滤器浓缩15、将蒸发盘放在通风机上，用65水浴换气干燥，冰箱冷却23min后，正确加入1mL苯和乙腈混合液。 在带有橡胶头的吸管前端充分混合残渣，用该吸管吸取上清液，转移到带有2mL塞子的试管中。 注意：苯结晶析出后，从冰箱中取出蒸发盘，继续溶解、混合，结晶消失。16，测定-单向展开法，1，薄板的制备：称量3g硅胶g，加入23倍量的水，研磨12min制成糊状后，用反向涂布机压在3片5cm20cm、厚度约0.25mm的薄层板上。 在空气中干燥15min，在100下活化2h，取出，用干燥器保存。 一般可以保存23d，放置时间长的情况下，可以活化使用。 17、点点地刮去附着在薄板边缘的吸附剂，从薄板的下端用微注射器或血红素吸管向3cm的基线上滴下样品液。 可以在一块板上滴4点，点的边缘和点的间隔为lcm，点的直径约为3mm，滴在同一板上的点的大小必须一致。 滴下的时候可以用吹风机吸入冷风再加入。 滴下方式为第一点： 10LAFTB、标准使用液(0.04g/mL )。 第二点： 20L样品液。 第三点： 20L样品液10L0.04g/mLAFTBl标准使用液。 第四点： 20L样品液10L0.02tLg，/mLAFTB。 标准使用液。18、展开和观察、在展开槽中加入无水醚10mL，展开12cm，使其挥发。 在另一个展开槽中放入10mL丙酮一二氯甲烷(8 92 )，展开1012cm，用紫外光观察，结果a .在样品液中滴入了AFTB1标准，因此，可以使AFTB1标准点与样品液中的AFTB1荧光点重合。 样品液为阴性的话，薄板上的第三点AFTB1为0.0004g，可以用于检查样品液中的AFTB1最低检出量是否正常出现的样品液为阳性时起到定性的作用。 薄层板第四点AFTB1标准为0.002ug .主要发挥定位作用。 b .在第二点和AFTB1基准点的对应位置上没有蓝色荧光点，样品中AFTBl的含量为5ug/kg的相应位置上有蓝色荧光点时，进行实证试验。 19 )，为了确认薄层样品液的荧光系统是从黄曲霉毒素B1产生的，滴加三氟乙酸产生AFTB1的衍生物，展开后该衍生物的比移值为0.1左右。 在薄层薄片的左侧各滴两点。 第一点： 10uL0.04ug/mLAFTBl标准使用液。 第二点： 20/L样品液，在上述两点中一点一点地加入三氟乙酸，使其反应5分钟后，用吹风机吹热风2分钟(板的温度为40以下)，再在薄板上滴下以下两点。 第三点： 10uL0.04ug/mLAFTBl标准使用液。 第四点： 20L样品液。 20、用以上方法展开观察，样品液是否产生与AFTB1基准点相同的衍生物。 未添加三氟乙酸的三、四点，可以顺序与标准衍生物进行空白对照。 稀释定量：样品液中AFTB1荧光点的荧光强度，如AFTB1。如果标准点的最低检测量(0.0004g )的荧光强度一致，则样品中的AFTB1含量为5g/kg。 如果样品液中的荧光强度比最低检测量强，则根据该强度减少滴下的微升数，或者在稀释样品液后，滴下不同的微升数，直到样品液的荧光强度与最低检测量的荧光强度一致。 滴下图案为第一点： l0uLAFTB1、标准使用液(0.04ug/mL )。 第二点：有时滴10uL样品液。 第三点：有时滴15uL样品液。 第四点：有时滴20uL样品液。 根据21、4 )结果，X=式中： x一个样品中的AFTBl的含量、ug/kg； 加入v1-苯乙腈混合液的体积、mL； v2-出现最低荧光时滴下的样品液的体积、mL； 加入d这样液体的总稀释倍数m1-苯乙腈溶解混合液时的相当样品的质量、g； 0.0004AFTBl的最低检测量，ug。22、测定-双向展开法，原理如采用单向展开法后，薄层色谱为了用杂质干涉掩盖AFTB1的荧光强度，需要采用双向展开法。 薄层板先用无水醚横向展开，干扰的杂质向样品液点的一侧展开，AFTB1不动，然后用丙酮二氯甲烷(8 92 )纵向展开，样品相应杂质的底色大幅减少，提高了方法的灵敏度。23，操作步骤，(1)点样品：取三片薄层板，在距下端3cm的基线上，用从左端0.81cm的第二编食品理化检查技术，滴下10uLAFTB1(0.04ug/mL )标准液，距左端2.83cm处，20uL样品接着，向第二张板的样品液点滴入l0uLAFTBl(0.04ug/mL )标准液，向第三张板的样品液点滴入10uLAFTB1(0.02ug/mL )标准液。 24，(2)展开： a .横展开：在展开槽内的长边上放置玻璃支架，加入无水乙醇10mL，将上述点好的片材接触标准点的长边，在展开槽内展开，展开至板端后，使其挥发。 有时，可以根据需要重复l2次。 b .纵向展开：干薄层板用丙酮-氯仿(8:92 )展开到1012cm。 丙酮和二氯甲烷的比例根据条件自己调节。 25、观察和评定的结果，a .用紫外光观察第一、第二板，第二板在AFTB1基准点的对应处出现最低检测量，在第一板和第二板的相同位置未出现荧光的情况下，样品中的AFTBl含量为5ug/kg.b . 如果荧光点出现在第一板和第二板的相同位置，将第一板和第三板进行比较，并对第三板的第二点和第一板的第二点的相同位置的荧光点是否与AFTB1的标准一致进行具体测量，三块板可以同时进行，也可以依次进行。 第一张板为阴性时，可以省略第三张板，第一张板为阳性时，可以省略第二张板，直接制作第三张板。26、确认试验，取2片薄层板，在距第四、五两板左端0.81cm的位置，分别滴加10uLATTB1(0.04ug/mL )标准液和三氟乙酸，在距左边缘2.83cm的位置，第四板上滴加20uL样品液和三氟乙酸使AFTBl(0.04ug/mL )标准液与一滴三氟乙酸反应5分钟后，用热风吹2分钟(板的温度为40以下)。 再用双向展开法展开后，观察样品液中是否产生与AFTB1基准点重叠的衍生物。 在观察时，第一板可以是样品液的衍生物空白板。 当样品液AFTB1含量高时，在稀释样品液后，通过单向