【基金标书】2010CB945200-基于诱导多能干细胞技术的若干重大疾病模型与机理研究

项目名称： 基于诱导多能干细胞技术的若干重大疾病模型与机理研究 首席科学家： 金颖 上海交通大学 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 上海市科委 一、研究内容 我们拟在本项目中开展一下研究内容 ： 1. 优化和完善建立人 胞的技术体系 ：本研究拟对现有的 胞诱导技术进行改进，构建新的非整合性细胞重编程因子表达载体，同时构建将细胞重编程因子输入体细胞的蛋白质直接运输系统及采用化合物及小分子进行输送的非病毒系统，筛选能够替代细胞重编程因子的小分子，建立并优化出高效 、安全的 胞诱导技术。 同时，我们还将对用于诱导 胞的体细胞种类进行研究，筛选出比成纤维细胞 更有效、更快速地 被 诱导成为 并且易于收集的体细胞。 此外，我们将对新方法建立的 胞系进行安全性检验。 2. 建立若干种重大疾病特异的 胞系 ： 为了有保证后续研究疾病发病机制和筛选新的疾病治疗靶点，我们将首先建立严重危害人民健康的重大疾病的胞系，重点选择我们项目组有一定研究基础的疾病，并优先考虑具有遗传起因的家族病例，包括神经系统 （阿尔茨海默病、帕金森病 和 小儿脊髓性肌肉萎缩症等 )重 大疾病 、 若干其它已知单基因或多基因改变的遗传性疾病（ 髓衰竭 综合征、 Y 染色体微缺失和 肥厚性心肌病）和目前尚不知道基因改变的重大 传染性 疾病（ 艾滋病 ） 。 当课题 1 建立新的方法后，我们将利用新的技术建立更多疾病患者特异的 胞系。 3. 利用疾病特异的 胞系研究 重大疾病的发生机制 ： 重点选择 神经系统 疾病 （阿尔茨海默病、帕金森病和 小儿脊髓性肌肉萎缩症等 )和肥厚性心肌病患者特异的 胞系， 以正常人 胞为对照，将疾病特异性 胞向相应疾病中的功能细胞定向诱导，比较 正常人和 患者 来源的 细胞 在分化过程中 以及 在 受到环境危害（如氧化应激）或过度刺激（ 况下的形态和功能，建立研究相关疾病的模型。 采用 深度测序技术研究 达谱，采用 术研究表观遗传学谱，分析正常细胞和疾病细胞之间细胞编程的差异，结合蛋白组学和质谱分析，有效地将全基因组表达改变与疾病的表型变化链接起来，为揭示疾病的发生机制和发现新的药物靶点提供依据。 4. 建立基于疾病细胞 模型 的药物评价和筛选体系 ：利用以上研究建立的 某 些特定疾病（肥厚性心肌病和 帕金森病） 的 细胞模型对于现有药物的疗效和剂量做出个体化的评估并筛选能使细胞表型逆 转的新药。同时结合疾病的发生机制研究结果获得新的治疗靶点，筛选出 针对新靶点的激活剂或抑制剂，实现对 若干 重大疾病的有效控制。 二、预期目标 （一）总体目标 ： 从解决重大疾病治疗和改善我国人民健康水平的需求出发，针对当前国际胞研究的关键问题，优化建立人 胞的技术体系，实现安全有效地建立疾病特异的 胞系；在此基础上 建立严重危害人民健康 和我们项目组有一定研究基础的 若干 重大疾病的 胞 系； 掌握疾病特异性 胞向相应疾病中的功能细胞定向诱导的技术方法，以此作为 模型研究这些疾病的发病机制；利用以上疾病模型，对现有药物做出个体化的评估， 并 发现新的治疗靶点和筛选新的药物，为这些重大性疾病的基础和临床研究开辟新的研究方法和技术平台。通过本项目的实施使我国在干细胞研究领域达到或领先国际水平。同时，以本项目为纽带，促进多学科、多院校的衔接和交流，尤其是基础研究与临床实践的密切结合，培养出一批优秀的干细胞研究人才。 （二）五年预期目标 1. 优化 和完善 建立人 胞的技术体系：包括 1）通过非病毒或 非基因组整合载体将重编程因子导入体细胞； 2）发现诱导多能干细胞产生的小分子化合物或新的细胞调控因子； 3） 筛选出可以被更有效、更快速地诱导成为 且易于获得的体细胞种类，为建立患者特异的 胞系提供平台。 2. 建立 包括神经系统 疾病 （阿尔茨海默病、帕金森病和 小儿脊髓性肌肉萎缩症等 )、 若干其它已知单基因或多基因改变的遗传性疾病（地中海贫血、 骨髓衰竭综合征、 Y 染色体微缺失和 肥厚性心肌病） 和目前尚不知道基因改变的重大 传染性 疾病（ 艾滋病 ） 等疾病患者特异 的 胞系 。 3. 诱导正常人和 患者 特异的 胞向有特定功能的细胞分化，应用分子生物学、细胞生物学、 生物物理等多种手段发现疾病细胞表型，建立可供研究的阿尔茨海默病、帕金森病、 小儿脊髓性肌肉萎缩症 和肥厚性心肌病的疾病细胞 模型。 4. 利用以上研究中建立的疾病模型，重点选择肥厚性心肌病和帕金森病，筛选能逆转疾病表型的新药。同时，基于疾病发生机制研究中 发现 的 可望获得重大疾病治疗的新靶点，筛选针对这些新靶点的化合物，为改善疾病的症状开辟新的途径。 5. 取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文 30篇 以上 。其中，在影响因子大于 5 的 刊物发表 15 篇以上。培养一批从事干细胞研究的基础研究与临床应用结合的优秀人才。 三、研究方案 1. 我们将在现有的建立 胞的手段的基础上，进一步优化和完善该技术体系。具体包括尝试通过非基因组整合病毒载体、非病毒载体、蛋白直接导入、小分子化合物、新的诱导因子等方法诱导成纤维细胞产生 胞系；同时，试验其它细胞类型，寻找比成纤维细胞更容易收集和更加容易诱导的细胞类型来建立 胞。通过这一研究实现更加安全有效地建立 胞系的计划。 2. 利用已经成熟建立 胞系的技术，即逆转录或慢病毒载体过表达四种转 录因子 （ 建立疾病特异的 们将优先选择严重影响我国人民健康 、 有遗传起因 、 本项目组有一定研究基础的重大疾病建立 胞系。 3. 在此基础上，通过生长因子诱导、与其它细胞共培养或形成类胚体的途径诱导正常人和 患者 胞向有特定功能的方向分化。比较正常和疾病 胞在正常或各种刺激条件下生长、分化、凋亡、附着、运动及细胞特有功能的不同，建立研究重大疾病的细胞模型。 4. 利用这些疾病细胞模型，运用各种组学技术，如采用 达谱，采用 术研究表观遗传学谱，分析正常细胞和疾病细胞之间细胞编程的差异，结合蛋白组学和质谱分析 、影像学和电生理的功能分析， 有效地将全基因组表达改变与疾病的表型变化链接起来。另外，根据每一种重大疾病中涉及到的基因产物不同，通过不同的生物化学、分子生物学、细胞生物学和物理学等手段进一步研究疾病发生分子机制。 5. 以上分子机制的研究有可能发现对疾病治疗的新的靶点， 针对这些靶点可以设计新的药物。 另外，利用建立的疾病细胞模型可以直接检验新药， 筛选对特异靶点或细胞表型有影响的 药物或手段，从而实现对重大疾病的有效控制甚至 个体化治疗。 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1. 构建表达 4 种重编程因子（ 非基因组整合载体，及 重编程因子 在体细胞的表达。参考 近发表的小鼠 胞诱导方法，建立质粒介导的人 胞诱导技术； 2. 体外表达可穿透细胞膜的 重编程因子 重组蛋白载体的构建和融合蛋白的表达和纯化 ; 3. 经患者所在医院医学伦理委员会通过和患者知情同意之后，收集建立疾病患者特异的 胞系的实验材料； 4. 建 立患者样本来源的体细胞系； 5. 建立 正常人 胞定向诱导分化为胆碱能神经元 , 多巴胺神经元，运动神经元 和心肌细胞 的技术平台 。 1. 完成编码 4 种重编程因子的非基因组整合载体构建和在体细胞的表达； 2. 完成 4 种重编程因子在体外的表达和纯化； 3. 建立获取患者样本的合符伦理的途径 ； 4. 建立患者体细胞细胞系 ； 5. 实现将 胞稳定的分化为胆碱能神经元，多巴胺神经元，运动神经元 和心肌细胞 的 技术平台。 第 二 年 1. 应用现有 的方法建立神经系统重大疾病和肥厚性心肌病患者特异的 胞系； 2. 比较不同来源体细胞重编程的效率； 3. 应用第一年构建的载体诱导体细胞重编程，建立 胞系； 4. 探索体外表达的融合蛋白进入细胞的最佳条件； 5. 对建立的 胞系进行常规鉴定； 6. 明确病人特异的 胞向功能特异的神经元分化能力与正常人1. 获得部分疾病患者特异的 胞系 ； 2. 发现重编程效率高的体细胞； 3. 建立非基因组整合的 胞系； 4. 建立体外表达的融合蛋白进入细胞的最佳条件； 5. 为课题 3 提 供 胞系 ； 6. 建立 胞定向诱导分化为胆碱能神经元 , 多巴胺神经元，运动神经元的技术平台，建立 D， 发病模型； 年度 研究内容 预期目标 胞的异同，并检测体外培养细胞的存活能力及生 理功能； 第 三 年 1. 研究 胞的小分子诱导技术。首先，筛选能够诱导 4 个内源基因表达的小分子，然后用这些小分子分别替代 4 种因子诱导产生 胞。 2. 研究应用体外表达和纯化的融合蛋白诱导 胞 ； 3. 将已知单基因或多基因改变的遗传性疾病（ 髓衰竭综合征和 Y 染色体微缺失）及艾滋病的体细胞诱导为 胞； 4. 比较正常 胞和肥厚性心肌病患者 胞向心肌细胞分化的差异； 5. 了解不同遗传背景的肥厚性心肌病 源心肌细胞功能和电生理学相关离子通道障碍的致病位点，选择相应临床药物进行疾病控制，并确认此种细胞模型获得的药物线索和临床实践的相关性。 1. 发现新的能分别诱导 4 种重编程因子的小分子，检验发现的小分子在诱导 胞中的作用； 2. 鉴定体外表达的重编程因子在在诱导 胞中的作用； 3. 获得 髓衰竭综合征、 Y 染色体微缺失等遗传性疾病及艾滋病患者特异的 胞 ； 4. 利用肥厚性心肌病患者来源 施临床药物筛选的 研究； 5. 利用 型探索帕金森病的发病机制，借助组学技术筛选关键差异蛋白或信号通路变 化。 第 四 1. 筛选对 胞的诱导有加速 /增强作用的小分子加速剂 /增强剂； 2. 继续优化诱导 胞技术，包括非基因组整合载体和体外表达蛋白技术 ； 3. 采用采用单细胞表达谱及和1. 发现并应用对 增强作用的小分子加速剂 /增强剂； 2. 实现高效安全地建立人的 胞系； 3. 鉴定区分正常人和患者的关键性表观遗传标志； 年度 研究内容 预期目标 年 术研究正常人和患者的 胞遗传和表观遗传学谱 ； 4. 在疾病特异 胞分化过程中，收集不同时间点的细胞，分别进行 达 谱 和达谱研究； 5. 发现 并鉴定 1在疾病发生过程中变化非常明显且与 病密 切 相 关 的 关 键 基 因 和时尝试找到相应靶基因 ； 4. 发现并鉴定在 疾病患者 胞分化过程中 的 1关键基因和对其功能做初步 研究； 5. 发表 3 录的高水平论文 ； 第 五 年 1. 对新方法建立的 胞系的安全性进行研究和鉴定； 2. 应用课题