现代植保实验技术简介

1、现代植保实验技术简介,一、实验室技术 二、田间试验技术,一、实验室技术 （一）实验室常用仪器设备 （二）植物病原菌的分离、培养与保存 （三）植物病原菌的接种 （四）分子植物病理学实验,一）实验室常用仪器设备,1、常用仪器： 培养皿、天平、显微镜、冰箱、冰柜、培养箱、智能温室、超净台、高压灭菌器、干燥箱、震荡器、电磁灶等 2、分子生物学仪器： Bio-Rad My cycler PCR仪，Alpha Innotech EP凝胶成像仪，JY600C型电泳仪，JYDF型电泳槽， U-2910紫外分光光度计1台，卧式-80超低温冰箱，Unique R-20超纯水器，湘仪H-2050R超低温高速离心机，

2、Eppendorf 5418离心机，Minibeadbeater组织研磨器1台，贝蒂IM（S）系列全自动雪花制冰机1台， HVE-50型全自动高压灭菌锅，Laica S6D立体显微镜，Laica DMLB正置生物显微镜（配备有荧光系统），SW-CJ-2FD型超净工作台,二）植物病原菌的分离、培养与保存,1、植物病原真菌的分离、培养与保存 （1）植物病原真菌的分离 一般采用组织分离法： 从病斑中切取边长为5mm的病组织，用70%酒精中浸几秒钟，再在0.1%酸性升汞水溶液中浸3-5min分钟，然后用灭菌水换洗3次，将其移置到琼胶培养基平板上培养。 稻瘟病是采用单孢分离法。 水稻纹枯病一般采用菌核分

3、离法,2）植物病原真菌的培养 一般采用马铃薯葡萄糖琼脂20g培养基（PDA），配方如下： 马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，水1000ml， 大多数真菌培养的温度是26-28，卵菌是22-25,3）植物病原真菌的保存 短期（3个月内）在PDA斜面低温（3-5）保存。 长期保存，如稻瘟病菌采用稻杆节在PDA低温（3-5）可保存10年以上。也可采用滤纸保存,2、植物病原细菌的分离、培养与保存 （1）植物病原细菌的分离 一般采用平板划线分离法： 取小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过2次后，放在灭菌水中，用灭菌的玻璃棒研淬，静置一定时间，用灭菌的移置环蘸取以上病组织液在琼胶平板上划线培养。先

4、在平板的一侧顺序划3-5条线，再将培养皿转60，将移置环灭菌后，从第二条线末端，顺序划3-5,2）植物病原细菌的培养 一般采用肉汁冻培养基，配方如下： 牛肉浸膏 3g,，酵母浸膏 1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼胶20 g，水1000ml。 细菌的培养一般是30 （3）植物病原细菌的保存 短期（3个月内）在斜面低温（3-5）保存。 长期保存，采用甘油保存、冷冻干燥保存,三）植物病原菌的接种,1、真菌的接种 （1）水稻稻瘟病菌的接种（叶瘟） 稻瘟病菌的培养； 稻瘟病菌的产孢； 水稻稻苗的栽培； 接种； 培养； 病害调查,2）水稻稻瘟病菌的接种（穗颈瘟,离体穗段点滴接种法，即从田间选取抽出

5、穗长12cm的穗株，剪成78cm长的穗段（穗颈节上1cm，节下67），等距离（间隔3 cm）滴入3滴浓度为1105个mL稻瘟病菌孢子悬浮液4L，在26光暗交替培养89天后按09级标准调查,3）水稻纹枯病菌的接种 纹枯病菌的培养； 水稻稻苗的栽培； 接种； 培养； 病害调查,4）小麦冠腐病的接种 小麦冠腐病菌的培养； 小麦苗的栽培； 接种； 培养； 病害调查,2、细菌的接种 水稻白叶枯病的接种 白叶枯病菌的培养； 接种； 病害调查,四）分子植物病理学实验,1）芦笋茎枯病的分子鉴定,分子生物学鉴定,不同省份的芦笋茎枯病菌菌株PCR扩增得到600 bp左右的条带（图1.2）。 BLAST比对结果显示

6、，所有菌株与芦笋茎枯病菌的相似度均为99%，将该病原菌鉴定为天门冬拟茎点霉Phomopsis asparagi，与形态学鉴定结果一致,图 不同省份菌株ITS4/5引物的PCR扩增 Note: M: DL2000 DNA marker; 1-5: FJ1-5; 6-7: LT1-2; 8-10: XT2-4; 11: HN1; 12-13: HN3-4; 15-20: SD1-6; 21-25: HB2-6; 14, 26: ddH2O,四）分子植物病理学实验,2）南方水稻黑条矮缩病的检测 材料与方法 标准样品 标准水稻黑条矮缩病毒（）和南方水稻黑条矮缩病毒（）的 由笔者所在实验室提供。 主要试

7、剂 提取试剂盒购自美国 公司；试剂盒购自大连宝生物公司；其他常用试剂均为国产分析纯,检测 水稻黑条矮缩病毒（）检测引物参照章松柏等设计的引物（：；：）；南方水稻黑条矮缩病毒（）检测引物参照王强设计的引物 （：；：）； 按照试剂盒说明书的标准程序进行,种病毒一步检测的方法 将 与 对引物按照（）、（）和（）的比例进行系列组合，采用的退火温度，按照试剂盒说明书的标准程序进行，筛选最佳的引物混合配比。同时，根据原引物的退火温度，将混合扩增体系的退火温度分别设置为、，按照筛选的最佳引物配比配制反应体系，按试剂盒说明书的标准程序进行，以筛选最佳的退火温度,检测方法的验证 用建立的方法对笔者所在实验室保存

8、的和标准样品的 进行扩增，验证一步检测方法的准确性与灵敏性。 样品的采集与鉴定 选择江西省大余县和南昌县水稻矮缩病发病较重的块稻田，每块田采集份样品，用建立的一步检测方法对样品进行病毒检测与鉴定,结果与分析 一步检测方法的建立 检测结果表明：将与对引物按（）的比例配制反应体系比较适合对引物的双重扩增；采用的退火温度进行对引物的双重，可以取得较佳的扩增效果。因此，试验采用与对引物按（）的比例配比，采用的退火温度进行对引物的双重扩增。反应体系和扩增条件的详细操作按照试剂盒说明书的标准方法进行,检测方法验证的效果 标准病毒样品的检测结果如图所示。由图 可知，个水稻黑条矮缩病毒（）标准样品均能扩增出左

9、右的条带，个南方水稻黑条矮缩病毒（）标准样品均能扩增出左右的条带,；，：标准水稻黑条矮缩病毒样品；，：标准南方水稻黑条矮缩病毒样品；：双蒸水,江西省水稻病毒样品的初步鉴定 江西省大余县份水稻病毒样品的鉴定结果如图所示，检测结果表明，大余县份样品均为南方水稻黑条矮缩病毒（），检出率为；南昌县份样品中的鉴定结果如图所示，检测结果表明：份样品中有份 样品检出南方水稻黑条矮缩病毒（），检出率为，另外份样品检出水稻黑条矮缩病毒（），检出率为,；：双蒸水；：标准水稻黑条矮缩病毒样品；：标准南方水稻黑条矮缩病毒样品；：大余县水稻病毒样品。 图大余县水稻病毒样品的鉴定,；：南昌县水稻病毒样品；：标准南方水稻黑

10、条矮缩病毒样品；：标准水稻黑条矮缩病毒样品；：双蒸水。 图南昌县水稻病毒样品的鉴定,二、田间试验技术 1、明确试验目的 2、制定试验方案 3、认真实施方案 4、撰写试验报告,例子1： 不同生态环境下2009年江西省主栽早稻品种稻瘟病的发生,1、材料与方法 1.1试验地点：在全省范围内选择生态环境不同的5个县，分别是信丰（赣南山区）、宜丰（赣西丘陵）、泰和（赣中平原）、婺源（赣东北山区）和永修县（赣北平原），各县均选择稻瘟病常发区进行试验。 1.2供试品种：包括（1）全省统一的11个品种：金优463、金优458、株两优02、株两优09、陆两优996、淦鑫203、T优898、先农37号、春光1号、

11、金优71、丽江新团黑谷（感病对照）；和（2）各县自选的品种：5个试验县均选择了当地种植面积较大的品种47个,1.3栽培与管理：同一个品种分3批播种，间隔期为5天，信丰、宜丰、泰和、婺源和永修县第一批播种的时间分别是4月9日、4月7日、4月2日、4月9日和4月10日。播种采用直播，先浸种催芽，待破胸后播种，每个品种播种面积为5m2，播种量为15克，小区之间间隔1尺，各品种按序号排列。试验田除不防治稻瘟病外，其余按正常农事操作，并适当多施N肥，诱发稻瘟病,1.4病情调查：分别在水稻分蘖盛期和黄熟期各调查一次叶瘟和穗瘟的发生情况，叶瘟和穗颈瘟均调查病株或病穗率，各小区采用平行跳跃式5点取样，每点调查

12、4丛，共调查20丛。 1.5 数据分析: 在本文中，将叶瘟小于1%的品种定为中抗，大于1%小于5%的品种定为中感，大于5%，小于10%的品种定为感病，大于10%的品种定为高感。将穗瘟发病率小于1%的品种定为抗病，大于1%，小于5%的品种定为中抗，大于5%，小于10%的品种定为中感，大于10%,小于20%的品种定为感病，大于20%的定为高感,2、试验结果,图1. 婺源县3个不同播种期的水稻品种穗瘟的发生,表1.不同水稻品种在三个试验点稻瘟病病叶率（%）比较,表2.不同水稻品种在三个试验点稻瘟病病穗率（%）比较,例子2： 30%吡唑醚菌酯氟环唑悬浮剂防治水稻纹枯病田间药效试验,1 试验目的 通过测

13、试供试药剂30%吡唑醚菌酯氟环唑悬浮剂对水稻纹枯病的防治效果，从而对供试药剂的药效及其对试验作物的安全性进行评价，为供试药剂的登记注册提供审批依据。 2 试验条件 2.1 试验对象、作物和品种的选择 水稻纹枯病（Rhizoctonia solani） 水稻，品种为926（晚稻） 2.2 作物栽培及环境条件 试验安排在江西省南昌县小兰乡涂家村晚稻田中进行。水稻于7月1日播种，7月28日移栽，水稻长势良好，各试验小区的土壤类型、栽培条件及水肥管理等均匀一致，整个水稻生育期未施过其它杀菌剂防治病害,3 试验设计和安排 3.1 药剂 3.1.1 试验药剂 30%吡唑醚菌酯氟环唑悬浮剂，北京华戎生物激素

14、厂提供。 3.1.2 对照药剂 250克/升吡唑醚菌酯乳油，巴斯夫欧洲公司生产；125克/升氟环唑悬浮剂，巴斯夫欧洲公司生产，5%井冈霉素水剂，山东曹达化工有限公司，以上3种农药均为市售产品,3.1.3 药剂用量与处理编号 表1 供试药剂试验设计,3.2 小区安排 3.2.1 小区排列 表2试验设计及安排,3.2.2 小区面积和重复 小区面积（或植株数）：25m2 重复次数：4次,3.3 施药方法 3.3.1 使用方法 使用喷雾器由低剂量至高剂量依次常规喷雾。 3.3.2 施药器械 使用华丰-16型背负式喷雾器，喷口孔径1.3mm，操作压力34kg/cm2。 3.3.3 施药时间和次数 3.3

15、.3 施药时间和次数 于2014年9月4日水稻孕穗期打第一次药、9月12日（水稻抽穗期）施第二次药，共施药2次。 3.3.4 使用容量 每公顷用药量兑水750升。 3.3.5 防治其他病虫害的药剂资料 全生育期未施用其它杀菌剂防治病害，杀虫剂施用按当地病虫情报时间进行防治,4 调查、记录和测量方法 4.1 气象及土壤资料 4.1.1 气象资料 第一次施药当天（9月4日）为晴天天气，气温为2231，药后8天为晴天、多云或阵雨天气；第二次施药当天（9月12日）为晴天天气，气温为2433，药后14天为晴天或多云天气，试验期间日最高气温为35，最低气温为20。施药当日试验地天气状况及试验期间气象资料详

16、见表5、表6。 4.1.2 土壤资料 粘壤土，PH值为6.3，肥力水平及土壤有机质含量较高，施过一次除草剂，田间杂草较少,4.2 调查方法、时间和次数 4.2.1 调查时间和次数 药前调查病情基数，第二次药后14天（9月26日）再调查一次。 4.2.2 调查方法 根据水稻叶鞘和叶片为害症状程度分级，以株为单位，每小区对角线5点取样，每点调查相连5丛，共25丛，记录总株数、病株数和病级数。调查分级标准如下,病情分级标准： 0级：全株无病； 1级：第四叶及其以下各叶鞘、叶片发病（以顶叶为 第一片叶）； 3级：第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病； 5级：第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病； 7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病； 9级：全株发病、提早枯死,4.2.3 药效计算方法,各级病株数相对级数值,病情