第四章抗体制药

1、笫C节 概述1890年Behring和北里柴三郎发 现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开 创了抗体制药。1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分离为白蛋白、a、队丫球蛋白, 并证明抗体活性主要存在于Y球蛋白 组分。抗体是指能与相应抗原特异性 结合具有免疫功能的球蛋白。抗体的产生：机体免疫系统受抗原刺激后，B淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。20世纪60年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病o 病人血清中出现同抗体结构类似的球 蛋白，统称为免疫球蛋白(immunoglobulin lg)。所以lg 是化学结构的概念，而抗体是生物学 功能的概念。多克隆抗

2、体：病原微生物含 有多种抗原决定簇的抗原物质， 因此这些抗体制剂也是多种抗体 的混合物，故称多克隆抗体。1975年 Kohler 和 Milstein 首先利用 B 淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(monoclonal antibody Me Ab)。单克隆抗体具有高度特异性、均一性、 来源稳定、可大量生产等特点，为抗体制 备和应用提供了全新的手段，还促进了基 础和临床医学的发展。单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。单克隆抗体用于临床治疗，CD3单 克隆抗体作为免

3、疫抑制剂对器官移植免 疫排斥有抑制作用。以单克隆抗体作为载体的药物对肿 瘤进行定向治疗。笫二节单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。抗原决定濮淋已细胞r t f -t0多克曬竝体04Vt 3h)U洗涤2.加杂交瘤培养上清M(A)(4V,lh)U洗涤3 加辣根过氧化物酶标记的 羊抗取抗体(金)(49.1h4.加酶作用底物.呈色孔为阳性克隆孔洗涤四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是 鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。单抗进行ig类和亚类鉴定：用羊或兔 抗ig不同类或亚类

4、抗体，进行免疫扩散或 ELISA鉴定。亲和力、特异性、纯度、分子量测定。五、单克隆抗体的大量制备体外培养法可获的4 Opg/ml抗体 体内诱生法可获的520mg/ml抗体 用BALB/c小鼠。降植烷一接种杂交瘤细胞一取腹水离心六、单克隆抗体的纯化依单抗igG类和亚类不同，选各种不同的纯 化方法。体内诱生法单克隆抗体的纯化方法: 1 离心取上清，超滤，盐析。2分离凝胶过滤用于IgG IgM单抗纯化。阴离子交换层析IgG单抗纯化。亲和层析IgG单抗纯化。第昙节氯源性单克隆抗体的改迭杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相对分

5、子量。人鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子 抗体。改造后的单抗的类型和特性类型基本结构相对分子质量人-鼠嵌合抗体人IgC-小鼠IgV150 000改形抗体小鼠CDRs替换人CDRs150 000Fab完整L链和Fd50 000FVW和25 000单链抗体(SCFV)舀-多肽-27 000单域抗体Vh或12 500最小识别单位(MRU)CDR2 000flBl再aKI警il竣基端Ig分子的结构模式图重链基因座（14号染色体）6 =100）L】Vi5+r：LnDh（1020）Jh隔矍5 1nsnnB ii892b（C& CdCr2 C/4比链基因座（2号染色体）（n= 100）b C4器官移植器官移植、

6、风湿性关节炎、节段性回肠炎（Crohns血ease）CI )5移植物抗宿主反应（GVHR）、类风湿关节炎、I型糖尿 病、系统性红斑狼疮（SLE）IL-2R(Tac)白血病和淋巴瘤、器官移植、GVHRTNFa脓毒性休克(Septic shock)HIVAIDSRSV呼吸道合胞病毒感染HSV单纯疱疹病毒感染Lewis Y肿瘤治疗PLAP肿瘤治疗CEA肿瘤治疗CD29抑制T淋巴细胞活化GDI 8抗炎症IgEGpIIb/IIIa介导I型变态反应抗血小板凝集及纤维蛋白的结合三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗 的V区片段，相对分子量为原抗体的 1/801/3。即保留CDR区，而lg分子中 的C

7、区不表达。小分子抗体类型有：Fab片段抗体; Fv抗体；单链抗体；单域抗体； 最小识别单位。单链抗体的优点： 可去除非特异性反应的竞争性表 面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性。 易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度。 免疫源性小，可消除人抗鼠的排 异反应。单链抗体大多在大肠杆菌中表达,有三种形式: 直接在细胞质中表达; 与其它菌体融合表达融合蛋白; 分泌表达具有功能的单链抗体O四、双功能抗体双功能抗体就是双特性抗体。它是一种非天然性抗体。其结合抗原的两个臂具 有不同的特异性。构建方法:1. 化学交联法 2生物学方法（杂种杂交瘤） 3.基因工程法五、抗体融合蛋白抗体融合蛋白广义属双功能抗体。 类型： 配

8、基配基型融合蛋白；1= 配基ig型嵌合蛋白； 配基型融合蛋白； 受体Fv型融合蛋白； 酶抗体型融合蛋白；第碉节基因工程抗体和抗体工程抗体研究进展3个阶段： 1890年白喉抗毒素，多克隆抗体; 1975年杂交瘤技术单克隆抗体；()1994年基因工程抗体。一、噬菌体抗体库技术的基本方法1=1 获取目的基因2. 抗体库技术的载体 3淘筛 4表达与鉴定二、噬菌体抗体库技术的特点1模拟天然全套抗体库2. 避开了人工免疫和杂交瘤技术3. 可获得高亲和力的人源化抗体 基因工程抗体表达1. 原核细胞表达 2真核细胞表达3. 转基因植物表达4. 转基因动物表达第玉节一、血清学鉴定用的抗体类试剂1鉴定病原菌的抗体

9、试剂(1) 常用诊断血清的品种和用途 沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清(2) 诊断血清的制备步骤制备细菌抗原 免疫动物和制备抗体血清(3) 诊断血清诊断方法2. 乙型肝炎病毒表面抗原的反向被动血凝诊断试剂3. 妊娠诊断试剂4. 抗ABO血型系统血清制品名称沙门氏菌属诊断血清 志贺氏菌属诊断血清 病原性大肠埃希氏菌诊断血清 霍乱弧菌诊断血清0多价血清 百日咳菌I相诊断血清 脑膜炎奈瑟氏菌诊断血清 钩端螺旋体诊断血清 布氏菌诊断血清 鼠疫菌诊断血清 炭疽菌沉淀血清 绿脓杆菌诊断血清小肠结肠灸耶氏菌诊断血清III1=1供诊断各型沙门氏菌供诊断各型志贺氏供诊断病原性大

10、肠埃希氏供诊断霍乱和副霍乱弧菌供诊断I相百日咳杆菌供脑膜炎奈瑟氏菌定群供钩端螺旋体定群检定光滑型布氏杆菌供鼠疫杆菌辅助诊断检验炭疽杆菌供诊断各型绿脓杆菌供诊断小肠结肠炎耶氏菌人红魏与血清的反应人血清与红辘的反应抗 B A 辘 M0 细 JSAB0MAB二、免疫标记技术用的抗体类试剂1荧光抗体诊断试剂(1) 荧光抗体的制备(2) 免疫荧光测定方法2. 免疫酶抗体诊断试剂(1)免疫酶染色法用抗体诊断试剂 (2)酶免疫测定用抗体诊断试剂测定方法敏感性单向扩散试验 双向扩散试验 对流电泳试验免疫电泳试验凝集试验间接被动血凝试验间接血凝抑制试验ELISABAS 一 ELISA放射免疫分析试验1 2mg

11、lmg 0. lmg 510mg lug lug O.lug lng lpg lpg3. 放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫技术是将放射性核素分析的 高度灵敏性与抗原抗体反应的特异性结合起来建立的检测技术。放射性核素标记抗体的方法: 氯胺T法 lodogen氏法抗原的测定有：夹心法；间接法； 竞争法常用标记抗体试剂有： HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂 HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂 HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂 AFP放射性核素标记抗体诊断试剂 CEA放射性核素标记抗体诊断试剂 小分子抗体易到达肿瘤部位，可显著 提高N/NT值。 抗体在肿瘤部位可保留69日 能观擦抗体在血中的半

12、衰期和可能出 现的不良反应。放射免疫显像定位技术 将抗肿瘤单克隆抗体（Ab）与二乙基三胺五乙酸（DTPA）在体外偶联成Ab-DTPA,再注入体内后，就能与体内 组织相结合。由于抗体分子量大，需3天 完成。3天后注入放射性核素ln-113M（半衰期100m）,因DTPA是重金属离子络合剂，所以ln-113M可以结合到 DTPA分子上，使肿瘤组织显像。这一过 程在2小时内可完成。建立预定位技术需解决3个问题: 抗体在肿瘤组织滞留要7天以上; Ab-DTPA偶联物比较稳定；内源性金属离子对DTPA的封闭作用 要小。第头节抗体治疗药物 以抗体为载体的导向治疗药物，还 不成熟。一、放射性核素标记的抗体治

13、疗药物抗体作为放射性核素的导向载体,标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。二、抗癌药物偶联的抗体药物1 常用的抗癌药物氨甲喋吟（MTX）、阿霉（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携 带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。2.抗体类药物逆转耐药性肿瘤细胞对抗原药物可产生多药耐药 性（MDR） o|=|=|=MDR是由基因调控的，其编码蛋白称 为P糖蛋白，其中P170是与肿瘤耐药相关 的主要蛋白，由Mdr1基因编码，1280氨 基酸残基，分子量170K。认为P蛋白是ATP酶依赖性药泵，药物 进入细胞后与P蛋白结合，利用ATP水解 释放的能量将药物泵出胞外，使胞内药物 蓄积减少，因而产生耐药性。三、毒素偶联的抗体药物1免疫毒素及其换代制品在导向药物中，毒素和抗体的交联 物称为免疫毒素。第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖 体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免 疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的 抗肿瘤作用。第三代免疫毒素重