拟南芥Athspr新基因的抗盐性及表达调控研究

1、拟南芥 Athspr 新基因的抗盐性及表达调控研究盐胁迫作为危害植物生长的逆境胁迫之一, 几乎对植物的所有生理生化过程都会产生极大影响。 然而 , 植物细胞可通过不同信号通路的相互作用, 在分子水平来调控不同基因的表达及其产物活性, 从而产生各种生理应答 , 最后使植物细胞适应高盐环境。植物遭受盐胁迫时 , 一般通过毒性盐离子的外排、区隔化和长距离运输、分子伴侣 HSPs (Heat Shock Proteins)的合成 , 以及胁迫响应基因的表达等策略适应高盐环境。在以上应答措施中 , 分子伴侣如 HSPs在逆境胁迫应答中所发挥的功能尤为关键 , 尤其在热激、干旱、盐及重金属等蛋白易受到损伤

2、的胁迫中,HSPs可保护植物细胞中具有重要功能的新生蛋白, 防止其变性 , 虽然目前关于 HSPs及其在盐胁迫应答耐受机制的研究已取得很多重要进展, 但是对于其具体分子机理和所涉及的新基因并未有报道。本研究以一个新的独角金内酯(Strigolactones,SLs) 相关的拟南芥 Athspr(Arabidopsis thaliana heat shock protein-related)基因及其 T-DNA插入的盐敏感性突变体作为研究对象, 采取常规形态学比较、生理生化技术、生物信息学、基因克隆、 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chainre

3、action)/QRT-PCR (Quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)、 Western-blot、基因工程等手段 , 通过 Athspr突变体的表型和盐耐受性分析、Athspr 基因的时空表达模式分析、Athspr 基因的互补、过表达和RNAi (RNA interference)干扰研究、以及正常和盐胁迫条件下野生型和突变体中盐胁迫相关基因的表达模式研究, 揭示出 Athspr 基因可能的部分耐盐机制。所取得的主要研究结果如下：1、在正常土培条件下 , 成熟Athspr 突变体各器官 (

4、 叶片、花序茎和果荚 ) 体积减小、叶片深绿和抽薹延迟。在正常 MS培养基条件下 ,Athspr突变体幼苗可以正常生长, 且与野生型没有明显表型差异。但在盐胁迫条件下,Athspr突变体种子萌发、幼苗及成熟植株的生长对 NaCl 都表现出超敏感性 , 并随着 NaCl 浓度升高而加剧 , 即使在 100 mMNaCl 胁迫下 , 突变体种子萌发和幼苗生长受到严重抑制, 叶片黄化 , 且导致 4 周大土培的成熟 Athspr 突变体植株存活率、 叶绿素含量和叶片含水量急剧降低, 细胞膜损伤程度显著高于野生型；而200 mMNaCl则会导致突变体直接死亡。此外 ,Athspr突变体幼苗对Na2SO

5、4和 Li+ 也表现出和在 NaCl 胁迫下相同的敏感表型；而在渗透胁迫下, 野生型和突变体幼苗的生长发育并无显著差异。2、采用 PLACE和 Phyre 在线软件分析了 Athspr 启动子元件和 ATHSPR蛋白的高级结构域。Athspr 启动子 (1670bp) 所包含的顺式作用元件主要分为五类：胁迫应答 ( 热激、低氧胁迫、盐胁迫 / 病原菌、脱落酸 / 干旱、冷胁迫和机械损伤 ) 、激素应答 ( 赤霉素、生长素、细胞分裂素和乙烯) 、光应答、组织器官特异性元件( 根、叶片和胚 / 胚乳特异性 ) 和转录必须元件。根据以上分析 , 我们将 1670bp 的 Athspr 启动子区域作为

6、 Athspr 全长基因克隆的一部分。与 ATHSPR蛋白相似结构域的主要有ClpB(Caseinolytic peptidase B)蛋白结构域和 AAA-ATPase结构域。根据对 Athspr 全长基因的分析 , 我们成功克隆出5.7kbp 的 Athspr 基因。3、QRT-PCR和 Western blot分析显示 Athspr 基因及其蛋白在野生型拟南芥不同组织器官中的表达模式由高到低依次为：花器官 > 花序茎 > 花序 >果荚 > 根> 叶片 > 幼苗。4、RT-PCR结果表明 Athspr 突变体能够表达 T-DNA插入之前的 Athspr

7、基因编码序列 , 而无法正常表达插入之后的序列, 且 Westernblot结果显示突变体也无相应的完整ATHSPR蛋白表达。5、通过研究 Athspr 启动子对盐胁迫的应答能力, 发现在正常条件下 ,PrOAthspr 驱动的 GUS (-glucuronidase)表达强度较弱；当150 mM NaCl处理 6h 和 12h 时, 可诱导 Athspr 启动子驱动的 GUS表达活性显著高于对照。此外 ,150 mM NaCl 可诱导野生型中 Athspr 基因的表达水平明显升高 , 而盐诱导后突变体中的 Athspr-mRNA表达显著高于野生型。但在盐处理条件下 , 突变体中的 ATHSP

8、R蛋白仍无表达。 6、将构建的pMDC99-ProAthspr:Athspr表达载体和 Athspr 基因的干扰表达载体RNAi-Athspr-pART27, 分别转化 Athspr 突变体和野生型 , 经 PCR和 Athspr 基因转录水平的验证 , 筛选出表型稳定的互补、过表达和RNAi 干扰转基因株系。互补转基因植株的表型和耐盐性已完全恢复至野生型。成熟的Athspr 过表达植株长势优于野生型 , 且耐盐性也有所提高。而 RNAi 植株则生长发育延缓、植株矮化、莲座叶数目变少、其抗盐性明显低于野生型 , 但略高于突变体。 7、QRT-PCR结果显示通过研究野生型与突变体中Na-/K+离

9、子转运相关基因 (SOS(Salt overly sensitive)、 NHX1(Na+/H+exchanger 1) 、HKT1 (High-affinity K+ transporter 1)和 CCO5(Ca2+activated outward rectifying K+ channel 5)、SL 合成及其信号转导基因、胁迫应答标志基因(RD29 (Responsive to dessication 29)、 DREB2A(Dehydration-responsive element-binding protein 2A)和 ERD10 (EarlyResponsive to De

10、hydration 10)及开花控制基因 GIGANTEA (GI)在正常与盐胁迫条件下的表达差异 , 结果发现在正常生长条件下, 以上基因的表达在野生型和突变体中都没有显著差异。但在 150 mM NaCl处理不同时间后 , 几乎所有基因在两者中都被显著诱导上调表达。8、盐胁迫条件下 , 野生型拟南芥幼苗中SOS1/SOS2/SOS3和 KCO5的表达显著高于突变体 , 且 SOS基因的转录表达速率也快于突变体, 其中野生型中SOS2ISOS3转录表达峰值的出现要比突变体早4h。而突变体中 SOS2抑制结合蛋白基因GI 和 NHX1的转录水平则显著高于野生型。 9、盐处理条件下突变体中SL

11、合成及信号转导基因MAX1(More axillarygrowth 1) MAX2/MAX3 的表达则普遍高于野生型。此外 ,NaCl 处理 12h 和 24h 时 , 与野生型相比 , 突变体中 MAX4的相对转录水平显著降低。 10、在 NaCl 胁迫的 8h 和 12h 或 24h, 突变体中 RD29和 DREB2A的转录水平普遍显著高于野生型。以上结果首先表明Athspr 基因作为 HSP100家族中的可能成员 , 其表达和功能发挥可能受到盐胁迫和发育信号的调控, 广泛表达于拟南芥几乎所有组织器官中。该基因的突变、 表达水平降低或蛋白缺失都会导致拟南芥生长发育迟缓、器官体积缩小、盐耐受性降低, 而互补和过表达则可恢复和促进拟南芥的生长发育及盐耐受性。因此 , 该基因在拟南芥生长发育和盐胁迫应