橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析

1、橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析橡胶树白粉菌 (Oidium heveae B A. Steinmann)是橡胶树白粉病的病原菌,具有专性寄生的特性 , 对天然橡胶的产量有极大的影响。橡胶白粉菌的相关研究主要集中在病原菌和寄主细胞学观察、病害预测防治方面, 而关于分子方面的研究 , 致病性相关基因及其功能鲜有报道。为验证橡胶树白粉菌致病过程中基因的表达差异和调控机制, 本实验在橡胶树白粉菌 HO-73菌株基因组和与橡胶品系7-33-97 互作转录组的基础上 , 筛选到致病和 MAPK信号途径相关基因 , 监测其在橡胶树白粉菌致病过程中的表达差异,为进一步验证其具体

2、功能提供理论基础。主要研究结果如下：1、用 HO-73菌株接种寄主培养12d 新鲜孢子接种在抽芽7-10d 叶龄橡胶叶片上 , 分别培养至 1d、3d、30d, 提取 RNA。在橡胶白粉菌基因组测序( 未发表 ) 基础上 , 通过 GO注释 , 选取其中 11 个和致病性相关的基因 (GO： 0009405), 进行克隆、 qRT-PCR扩增 , 分析其在致病过程中的表达差异 , 并与转录组相对应。结果表明：在1dpi (day past infection),初次侵染器官附着胞、吸器等发育完成,Oh-Imp 、 Oh-hypotheticalprotein-4为上调基因 , 其可能与侵染初期

3、侵染器官的生长相关；3dpi 菌丝体生长时期 , 代谢基因 Oh-PC2、Oh-Gproteinbeta subunit/AC1 、Oh-EKA,生长基因 Oh-AAAperoxin,Oh-RNP和 Oh-Imp; 假定蛋白 Oh-hypotheticalprotein-1,2,3,为上调基因 , 这些基因可能与菌丝生长密切相关； 30dpi 产生新生分生孢子阶段 , 代谢基因 Oh-PC2,生长基因 Oh-RNP,假定蛋白 Oh-hypothetical protein-1,2,3为上调基因 , 这些基因可能与分生孢子产生有关。2、利用橡胶白粉菌基因组数据库和小麦白粉菌(Blumeriagr

4、aminis) 的同源序列进行比对 , 获得 25 个 MAPK信号途径相关基因。并运用蛋白质结构域及聚类分析 , 构建橡胶树白粉菌中的MAPK级联途径简图 , 共发现了 1 个 MAPK基因、1 个MAPKK基因和 3 个 MAPKKK基因 , 为继续探究植物病原真菌MAPK信号途径基因的功能奠定了基础。橡胶白粉菌在 parafilm表面培养 0-24hpi(hours post inoculation)的侵染发育可大致归纳为未萌发(0hpi) 、萌发 (4hpi) 、附着胞形成 (6 、8hpi) 和次生附着胞 (16 、24hpi) 等 4 个形态发育阶段； 在此基础上检测MAPK信号途

5、径相关的基因在 parafilm表面的表达差异情况。在4hpi 芽管生成时 , 全部基因为上调 ,上调倍数较大的基因有20892、18727、8311 和 4961, 证明 MAPK途径的 Fus3andKss1pathway 在芽管生成时发挥主要作用；8hpi 附着胞形成时 , 全部基因也都为上调基因 , 上调倍数明显增大的为基因1505、4241、4865、5368、18727、20892,证明 MAPK信号途径中的 MEK1、Bkk1、Bck1 和 Wis4 在附看胞形成过程中起主要作用； 16hpi 吸器形成时 ,4961 为下调基因 , 剩余为上调基因 , 明显上调的基因为1505、

6、4241、9052、20892, 证明在吸器形成时 ,MAPK途径中的 Hog1MAPKpathway起主要作用；24hpi 菌丝生成时 , 全部基因为上调 , 明显上调的基因为4241、4961、8311、18727、9052 和 20892, 证明在此阶段起主要作用的为MAPK途径中的Hog1pathway。用 MAPK信号途径特异性外源抑制剂 U0126处理 , 促使白粉菌在非诱导琼脂表面萌发并形成附着胞。在 1.0%琼脂培养介质中加入浓度为 10mol/L-30 mol/L 浓度梯度的 U0126。结果表明 , 随抑制剂 U0126的浓度增加 , 孢子萌发率明显下降 , 且与未加入抑制剂的对照有显著差异 (P<0.05)。24hpi 时 ,10 mol/L 最终萌发率为 57%,20 mo