玉米WRKY转录因子Ⅱd亚族抗逆相关基因的鉴定及ZmWRKY17的功能分析

1、玉米 WRKY转录因子 d 亚族抗逆相关基因的鉴定及ZmWRKY17的功能分析玉米是世界范围内重要的粮食作物之一, 是公认的黄金食物。但是其生长发育和产量品质受到干旱、 盐渍等非生物胁迫的严重影响, 挖掘抗逆相关基因 , 研究其逆境应答机制 , 培育抗逆性较强的玉米新品种是应对逆境胁迫, 提高玉米产量的最有效途径。近些年的研究表明 , 转录因子在植物的生长发育及胁迫应答方面起着非常重要的作用。过量表达一个特定的转录因子能够调控下游多个抗逆相关基因的表达,从而达到对作物进行综合改良的效果。WRKY蛋白家族是目前研究比较热门的逆境相关转录因子家族之一, 其家族成员尤其是 d 亚族成员广泛参与了植物

2、对各种胁迫的应答反应、生长发育、代谢调控等一系列生理活动。本研究首先对玉米中d 亚族 WRKY基因的诱导表达模式、转录活性、以及钙调素结合特性等分子特征进行了系统分析。从玉米中克隆了胁迫相关关键基因ZmWRKY17,通过过量表达技术对ZmWRKY17在转基因植物中的抗逆功能进行了验证, 并利用转录组测序技术对其作用机制进行了初步探索, 获得了如下主要结果 :1. 对玉米中 12 个 d 亚族 WRKY基因的分子特性进行了分析。研究发现 , 玉米中 7 个 d 亚族 WRKY基因的表达均受到干旱和高盐胁迫的诱导。克隆得到其中 6 个基因。酵母转录活性分析表明这6 个 d 亚族 WRKY基因在酵母

3、中均不具有转录激活能力。酵母双杂交实验表明 ,6 个 d 亚族 WRKY蛋白均能够与钙调素发生相互作用。2. 根据进化关系和诱导表达模式分析结果, 选取了 ZmWRKY17作为关键基因进行下一步的功能分析。序列分析显示 ,ZmWRKY17基因 cDNA全长为 996bp, 编码 331 个氨基酸 , 与玉米B73 数据库中公布的序列完全一致。通过荧光定量PCR进一步对 ZmWRKY17的表达特性进行分析 , 发现该基因的表达还受到外源ABA的诱导。组织表达模式分析显示 ,ZmWRKY17在根、茎、叶、花丝、雄穗、果穗和胚7个组织中均有表达 , 其中以雄穗中的表达水平最高。亚细胞定位结果显示 ,

4、ZmWRKY17-GFP的融合表达蛋白定位在细胞核中。酵母单杂交实验表明 ,ZmWRKY17能够与 W-box序列发生特异性的结合。 3. 构建了 ZmWRKY17过量表达载体 , 并通过农杆菌介导的方法获得了多个拟南芥转基因株系。对转基因植株和野生型植株进行了抗盐表型鉴定实验, 结果表明 : 在高盐胁迫处理后 , 转基因植株的相对电解质渗透率和丙二醛含量均明显高于野生型植株,说明过量表达 ZmWRKY17提高了转基因植株对高盐胁迫的敏感性。4.ABA敏感性实验显示 ZmWRKY17的过量表达降低了转基因植株对外源ABA的敏感性。另外 , 在外施 ABA合成抑制剂的情况下 , 转基因株系的种子

5、在高盐胁迫下的萌发受强烈抑制的表型得到恢复。 5. 对 ZmWRKY17作用机制进行了初步探索, 通过转录组测序对高盐胁迫处理前后的拟南芥植株( 包括野生型植株和转基因植株)进行了基因差异表达分析。结果发现 , 野生型拟南芥在高盐处理后共获得316 个差异表达基因 , 转基因株系中共获得 334 个差异表达基因。通过对 RD29B、RAB18、KIN1、DREB1F、bHLH92等多个胁迫应答功能基因的表达变化分析发现, 在高盐条件下 , 这些抗逆功能基因在转基因拟南芥中的表达上调变化程度显著低于野生型植株。而 ABA合成相关基因 NCED5在转基因拟南芥中的表达上调变化程度显著高于野生型植株。 综上所述 , 本研究首先对玉米中 d 亚族 WRKY基因的分子特性进行了分析。根据诱导表达模式、进化关系和序列特征等分析结果 , 选取了 ZmWRKY17作为关键基因进行下一步的功能研究。 过量表达该基因显著提高了转基因植株对高盐胁迫的敏感性 , 同时 , 转基因植株对 ABA的敏感性降低。转录组测序结果证实野生型植株和转基因株系在高盐处理后, 一