环境工程微生物学-微生物污染及其检测技术

1、第8章 微生物污染及其检测技术 微生物与环境污染 v水体中的病原微生物水体中的病原微生物 表10-1 通过粪便进入水体的病原体 细菌细菌病毒病毒其他其他* 沙门氏菌属沙门氏菌属脊随灰质炎病毒脊随灰质炎病毒溶组织内阿米巴溶组织内阿米巴 志贺氏菌属志贺氏菌属考克赛基病毒考克赛基病毒结肠小袋虫结肠小袋虫 致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌肠细菌病变人孤儿病毒肠细菌病变人孤儿病毒人等孢子球虫人等孢子球虫 变形杆菌属变形杆菌属呼肠孤病毒呼肠孤病毒兰伯氏贾弟虫兰伯氏贾弟虫 克雷伯氏杆菌属克雷伯氏杆菌属腺病毒腺病毒日本血吸虫日本血吸虫 土拉热弗朗西丝氏菌土拉热弗朗西丝氏菌轮状病毒轮状病毒钩虫钩虫 假单胞杆菌属假单

2、胞杆菌属肝炎病毒肝炎病毒蛔虫蛔虫 沙雷氏杆菌属沙雷氏杆菌属胃肠炎病毒胃肠炎病毒 小肠结肠炎耶尔森氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌 以虫卵、包裹、幼虫等形式进入以虫卵、包裹、幼虫等形式进入 水体水体 空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌 霍乱弧菌霍乱弧菌 水体中的主要病原微生物类群水体中的主要病原微生物类群 v沙门氏菌属沙门氏菌属(Salmonella） v志贺氏菌属志贺氏菌属(Shigella） v霍乱弧菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae) v肠道病毒属肠道病毒属(Enterovirus) v甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒(hepatitis A virus） Salmonella typhimurium (r

3、ed) invading cultured human cellsLT2A-SL1344 genome Shigella sonne的部分特性的部分特性 Shigella typhimurium 微生物代谢物与环境污染微生物代谢物与环境污染 v 氨氨 v 硝酸与亚硝酸硝酸与亚硝酸 v 氮氧化物氮氧化物 v 硫化氢硫化氢 v 酸性矿水酸性矿水 v 甲基汞甲基汞 v 农药代谢的毒性产物农药代谢的毒性产物 v 细菌毒素细菌毒素 肉毒毒素肉毒毒素(botulin) 葡萄球菌肠毒素葡萄球菌肠毒素 放线菌毒素放线菌毒素 放线菌素放线菌素 链脲菌素链脲菌素 洋橄榄霉素洋橄榄霉素 真菌毒素真菌毒素 以黄曲霉毒

4、素为例以黄曲霉毒素为例 剧毒剧毒, 黄曲霉黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生和寄生 曲霉曲霉(Asp. parasiticus)产生产生 紫外线照射下可发出荧光紫外线照射下可发出荧光 B族和族和G族，蓝色荧光和绿色荧光族，蓝色荧光和绿色荧光 已确定结构的黄曲霉毒素有已确定结构的黄曲霉毒素有17种，种， 其中以黄曲霉毒素其中以黄曲霉毒素1毒性最大，毒性最大， 致癌力最强。致癌力最强。 藻类毒素藻类毒素 甲藻甲藻 蓝细菌毒素蓝细菌毒素 :微囊藻快速致死因子微囊藻快速致死因子 (Microcystis FDF) 第一章第一章 环境监测中的微生物学方法环境监测中的微生物学方法 v当环

5、境受到污染后，环境的物理性质、当环境受到污染后，环境的物理性质、 化学性质和生物学特性化学性质和生物学特性发生变化发生变化, 如：如： 重金属离子、重金属离子、NO3- 浓度增加；浓度增加； 水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝。水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝。 如何监测？如何监测？ v化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但 为瞬时值；为瞬时值； v生物学方法：利用生物学方法：利用生物种类生物种类、数量的变化数量的变化，生物生物 学特性的改变学特性的改变来监测污染物对环境的影响。来监测污染物对环境的影响。 v生物学方法的特点：可监测到

6、污染物对环境的综合影生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影 响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。 一、空气微生物来源一、空气微生物来源 v空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分 和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。 v土壤中飞扬起来的灰尘；土壤中飞扬起来的灰尘； v水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物 质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传 播。播。 第一节第一

7、节 空气的卫生学检验空气的卫生学检验 v微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空 气中，形成气中，形成 “气溶胶气溶胶”，借风力传播。，借风力传播。 v空气中的微生物中，真菌的孢子数量最空气中的微生物中，真菌的孢子数量最 多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病 毒都会存在于空气中毒都会存在于空气中 。 Infection Transfer -Airborne Droplet Nuclei 二、空气微生物的卫生标准二、空气微生物的卫生标准 v目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般 以室内以室内

8、1m3 空气中细菌总数为空气中细菌总数为501,000个以上作个以上作 为空气污染的指标。为空气污染的指标。 v病原菌在空气中易死亡，但病原菌在空气中易死亡，但结核菌、白结核菌、白 喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球 菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎 病毒等病毒等，也可以在空气中存活一段时间。，也可以在空气中存活一段时间。 v尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医 院、城市街道的空气中，微生物数量较院、城市街道的空气中，微生物数量较 多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和多。高山、海洋、森林、积雪的

9、山脉和 高纬度地带的空气中，微生物较少。高纬度地带的空气中，微生物较少。 场所场所畜舍畜舍宿舍宿舍 城市城市 街道街道 市区市区 公园公园 海洋海洋 上空上空 北纬北纬 80 微生物微生物 (12) 106 2104 5 5103 200120 表表2-1 不同场所上空微生物的数量（个不同场所上空微生物的数量（个/m3 ） 表表2-2 以细菌总数评价空气的卫生标准（个以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3 ） 清洁程度清洁程度细菌总数细菌总数 最清洁的空气（有空调）最清洁的空气（有空调）12 清洁空气清洁空气30 普通空气普通空气31125 临界环境临界环境150 轻度污染轻度污染301 三、

10、空气的微生物监测三、空气的微生物监测 v采用营养琼脂平板计数法采用营养琼脂平板计数法。 v培养皿直径为培养皿直径为d90mm和和d100mm。 v评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生 物数量和空气污染微生物。物数量和空气污染微生物。 细菌指标：细菌总数和绿色链球菌 必要时测定病原微生物。 ( (一一) )空气微生物测定空气微生物测定 1 1固体法固体法 平皿落菌法平皿落菌法(沉降沉降平板法平板法)、 撞击法撞击法(缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器) 过滤法。过滤法。 (1)(1)平皿落菌法平皿落菌法 培养基融化倒入

11、培养基融化倒入d90mm无菌平皿制成平板无菌平皿制成平板, 置于待测点置于待测点(通常通常5个个)， 打开皿盖暴露于空气打开皿盖暴露于空气510min， 盖好皿盖，盖好皿盖，30培养培养48h； 计菌落数。计菌落数。 v通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。 v奥氏假设：奥氏假设：5 min内落在面积内落在面积100 mm2营养琼脂营养琼脂 平板上的细菌数和平板上的细菌数和10L空气中所含的细菌数相同。空气中所含的细菌数相同。 奥氏公式：奥氏公式： 式中：式中：C空气细菌数；空气细菌数； A捕集面积，捕集面积，cm2 ； t 暴露时间，暴露时间，min； N菌

12、落数，个。菌落数，个。 5 t 100 A 1000 10 NC = v简化后：简化后： 奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。 没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密 度和活动情况。度和活动情况。 C = 100050N At (2)撞击法：撞击法： v以缝隙采样器为例，以缝隙采样器为例， 用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝（宽度有用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝（宽度有 0.15 mm、0.33 mm和和1 mm三种三种)抽吸到营养琼脂培抽吸到营养琼脂培 养基平板上。养基平板上。 狭缝长度为平皿半径，平板与缝

13、间距狭缝长度为平皿半径，平板与缝间距2mm， 平板转速平板转速:1 r/min、5-60r/min、60r/min。 根据空气中微生物密度调节平板转动的速度根据空气中微生物密度调节平板转动的速度 含菌高，转动快；含菌低，转动慢。含菌高，转动快；含菌低，转动慢。 由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。 采样器的规格各国不一，操作有差异。采样器的规格各国不一，操作有差异。 培养前培养后 撞击法检测空气中微生物数量撞击法检测空气中微生物数量 2 、液体法、液体法 v测定空气中悬浮微生物，主要细菌测定空气中悬浮微生物，主要细菌 将将一定体积一定体积的含菌空气通

14、入无菌蒸馏水，使微生物的含菌空气通入无菌蒸馏水，使微生物 均匀分布在水中，均匀分布在水中， 取取一定量菌液一定量菌液于无菌培养皿中，倒入于无菌培养皿中，倒入15-18ml融化的融化的 培养基，混匀、冷凝成平板，培养基，混匀、冷凝成平板， 37培养培养48h，计菌落数计菌落数。 以菌液体积和通入空气量计算出单位体积空气中的以菌液体积和通入空气量计算出单位体积空气中的 细菌数量。细菌数量。 例如：例如： l10m3含菌空气通入含菌空气通入100mL的无菌水，微生物全的无菌水，微生物全 部截留在水中。部截留在水中。 l取取0.1 mL菌液涂布于平板上，菌液涂布于平板上， 长出长出100个菌落，则个菌

15、落，则10mL水中含菌水中含菌10,000个，个，10m3 空气含有空气含有10,000个。个。 1m3空气含有空气含有1,000个个 。 ( (二二) )空气微生物的检测点数空气微生物的检测点数 v空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作 方便，又相对准确，以方便，又相对准确，以2030个测点数为宜，最个测点数为宜，最 少测点数为少测点数为56，见表。，见表。 时时 间间 标准标准 名称名称 最少最少 测点测点 数数 建议建议 测点测点 数数 点距点距 （m） 每点每点 测定测定 次数次数 1987 JIS B 9920 洁净室中浮洁净室中浮 游粒

16、子游粒子 测定方法和测定方法和 洁净室的评洁净室的评 价方法价方法 6 20， 30 原则原则 上上3 空间太空间太 大大 可放可放 宽宽 3 1987 空气清空气清 净协净协 会标准会标准 洁净室性能洁净室性能 评价指南评价指南 5 20, 30 原则原则 上上3 表表 1 日本有关标准测点数的规定日本有关标准测点数的规定 摘自许钟麟空气洁净技术原理P522同济大学出版社，1998 表2 按美国联邦标准209E方法计算的必要测点数 洁洁 净净 度度 进风面积进风面积 (单向流单向流) 或室面积或室面积 (乱流乱流) m2 100级及级及 高于高于100 级级 1000 级级 10000 级级

17、 100000 级级 10 10 20 40 80 100 200 400 23 4 8 16 32 40 80 160 2 3 6 13 25 32 63 126 2 2 2 4 8 10 20 40 2 2 2 2 2 3 6 13 表 3 浮游菌最小采样量 浮游菌上限浓度浮游菌上限浓度 个个 m-2 min-1 计算最小采样量计算最小采样量m3 10 5 1 0.5 0.1 0.05 0.3 0.6 3 6 30 60 表表4 4 落菌法测细菌所需要的最落菌法测细菌所需要的最 少培养皿数少培养皿数( (沉降沉降0.5h)0.5h) 含尘浓度最大值含尘浓度最大值 需要需要d90mm培养皿数

18、培养皿数 0.35 3.5 35 350 3 50035 000 40 13 4 2 1 第二节第二节 水质的细菌学检验水质的细菌学检验 一、一、细菌总数细菌总数 v将将定量水样定量水样（原水样或稀释水样（原水样或稀释水样1mL）接种）接种 于于牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板琼脂培养基平板 v37C培养培养24hr后观察结果，计后观察结果，计菌落数菌落数， v计算原水样每毫升的细菌总数。计算原水样每毫升的细菌总数。 u具有相对的具有相对的卫生学意义卫生学意义： 菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越重，病菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越重，病 原菌污染的可能性亦大原菌污染的可能性

19、亦大（为什么？）（为什么？）。 二、粪便污染指示菌二、粪便污染指示菌 v人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生 学检验，对于保护人群健康，具有重要意义学检验，对于保护人群健康，具有重要意义 有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物， 有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污 染，从而引发各种肠道疾病。染，从而引发各种肠道疾病。 v致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即 粪便污染指示菌为代表。粪便污染指示菌为代表。

20、以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的 指示。指示。 健康成人粪便内的微生物数量健康成人粪便内的微生物数量 微生物名称微生物名称每克粪便中平均生长菌落数每克粪便中平均生长菌落数 主要微生物 拟杆菌属1010 乳酸杆菌属109 大肠埃希氏菌属108 粪链球菌108 次要的微生物 柠檬酸杆菌属105-106 梭菌属105-106 葡萄球菌属105-106 克雷伯氏菌属104-105 肠杆菌属104-105 芽孢杆菌属酵母属104-105 霉菌104-105 较少的微生物 变形菌属102-103 铜绿假单胞菌属102-103 （一）指示菌的理想条

21、件（一）指示菌的理想条件 1. 大量存在于人的粪便，数量比病原菌多；大量存在于人的粪便，数量比病原菌多； 2. 受粪便污染的水中易检测出，未受污染的水中受粪便污染的水中易检测出，未受污染的水中 无检测；无检测； 3. 在水体中不会自行繁殖；在水体中不会自行繁殖； 4. 存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强 于致病菌；于致病菌； 5. 检出及鉴定方法比较简易迅速；检出及鉴定方法比较简易迅速； 6. 适用于各种水体。适用于各种水体。 （二）适宜的指示菌（二）适宜的指示菌 v总大肠菌群，总大肠菌群， v粪大肠菌群、粪大肠菌群、 v大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌

22、）大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌） v克雷伯氏菌属。克雷伯氏菌属。 三、大肠杆菌三、大肠杆菌 （一）特征（一）特征 大肠杆菌定义：大肠杆菌定义： v一群一群需氧或兼性厌氧性需氧或兼性厌氧性的的G-无芽孢杆菌无芽孢杆菌，37C培养培养24hr， 能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全部兼性需氧性能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全部兼性需氧性G- 杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，以及柠檬酸杆菌属、杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，以及柠檬酸杆菌属、 肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。 成人粪便排出菌数可达成人粪便排出菌数可达(5100)106 cfu/d。 （二）大肠菌群的测定（二）大肠菌

23、群的测定 v常用多管发酵法或滤膜法。常用多管发酵法或滤膜法。 1.发酵法：又称发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法多管发酵法或三步发酵法 1)初发酵（推测试验）初发酵（推测试验） v将不同稀释度的水样，分别接种于含乳糖等将不同稀释度的水样，分别接种于含乳糖等 糖类的培养液糖类的培养液(3倍或倍或1倍乳糖液倍乳糖液), v37C培养培养24hr，观察产酸产气情况，观察产酸产气情况， v初步判断是否有大肠菌群存在。初步判断是否有大肠菌群存在。 2）平皿分离（证实试验）平皿分离（证实试验） v水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要 进一步证实。进一步证实。 v

24、初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养 基或远藤氏培养基上，基或远藤氏培养基上，37C培养培养24hr， v根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片，根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片， v革兰氏染色证实是否为大肠菌群。革兰氏染色证实是否为大肠菌群。 3） 复发酵试验（完成试验）复发酵试验（完成试验） v将大肠菌群疑似菌落再次接入将大肠菌群疑似菌落再次接入1倍乳糖液，倍乳糖液， 37C培养培养24hr，产酸产气者即确证为大肠菌群。，产酸产气者即确证为大肠菌群。 结果计算结果计算 产酸、产气记为阳性反应，产酸、产气记为阳性反应， 不产酸、不产气记为阴性反应。不产酸、不产气记为阴性反应。 根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。 2 2 滤膜法滤膜法 v发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，可以发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，可以 采用滤膜法，其步骤为：采用滤膜法，其步骤为： 1）水样过滤：）水样过滤：选用微孔滤膜，灭菌后