细菌染色技术

1、基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 微生物染色的染料微生物染色的染料 是一类苯环上带有发色基团和助色基团的是一类苯环上带有发色基团和助色基团的 有机化合物。有机化合物。 染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料 两大类。两大类。 在微生物染色中，碱性染料较常用，如常在微生物染色中，碱性染料较常用，如常 用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性紫用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性紫 复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于 碱性染料。碱性染料。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 v在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞

2、在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞 通常带负电荷；通常带负电荷； v而碱性染料在电离时，其分子的染色部分而碱性染料在电离时，其分子的染色部分 带正电荷；带正电荷； v带正电荷的碱性染料染色部分很容易与带带正电荷的碱性染料染色部分很容易与带 负电荷细菌细胞结合使细菌染色。负电荷细菌细胞结合使细菌染色。 微生物染色原理微生物染色原理 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 材材 料料 1. 菌种菌种 2. 染色剂染色剂 3. 仪器或其他用具：仪器或其他用具： 显微镜显微镜 酒精灯酒精灯 载玻片载玻片 接种环接种环 香柏油香柏油 酒精酒精+乙醚乙醚 擦镜纸擦镜纸 生理盐水等。生理盐水等。 基

3、础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色水洗水洗 镜检镜检 简单染色方法简单染色方法 干燥干燥 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革兰氏染色革兰氏染色 菌种菌种: : 参考菌：参考菌：G+：Staphylococcus aureus, G-: Escherichia coli 仪器仪器 显微镜；显微镜； 材料材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸， 吸水纸，染色缸等。吸水纸，染色缸等。 染料染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)(Lugol) 碘液，碘液，95%95%乙醇，乙醇

4、，0.5%0.5%番红染色液；番红染色液； 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较 成分成分 占细胞壁干重的占细胞壁干重的% 革蓝氏阳性菌革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌革蓝氏阴性菌 肽聚糖肽聚糖 含量很高（含量很高（50-9050-90） 含量很低（含量很低（1010） 磷壁酸磷壁酸 含量较高（含量较高（5050） 无无 类脂质类脂质 一般无（一般无（ 2 2） 含量较高（含量较高（2020） 蛋白质蛋白质 无无 含量较高含量较高 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革蓝氏染色的意义革蓝氏染色的意义 细菌分类鉴定细菌

5、分类鉴定 指导临床用药指导临床用药 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 微生物分类鉴定的特征微生物分类鉴定的特征 v形态学形态学和生理生化特征和生理生化特征 v血清学实验和噬菌体分型血清学实验和噬菌体分型 v氨基酸序列和蛋白质分析氨基酸序列和蛋白质分析 v核酸碱基组成和序列分析核酸碱基组成和序列分析 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 形态学特征形态学特征 v培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、光泽等面特征、光泽等 v细胞形态：形状、大小、排列方式细胞形态：形状、大小、排列方式 v特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等特殊结构：鞭毛

6、、芽孢、孢子、荚膜等 v细胞内涵物细胞内涵物 v染色反应：革蓝氏染色、抗酸性染色染色反应：革蓝氏染色、抗酸性染色 v运动性运动性 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 方法方法 v涂片涂片 v初染初染 v媒染媒染 v脱色脱色 v复染复染 v镜检镜检 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 涂片涂片 v要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色; ; v注意练习无菌操作；注意练习无菌操作； v在载玻片上滴半滴生理盐水；在载玻片上滴半滴生理盐水； v取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔痕 迹即可；迹即可； v菌苔在生理盐

7、水中涂片要均匀，局部不宜菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不宜 过厚过厚, ,以免脱色不完全造成假阳性。以免脱色不完全造成假阳性。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 初染初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸将玻片置于玻片搁架上，加草酸 铵结晶紫染色液铵结晶紫染色液( (加量以盖满菌膜为度加量以盖满菌膜为度) )， 染色染色1-2min1-2min。倾去染色液，用自来水小心。倾去染色液，用自来水小心 地冲洗。地冲洗。 媒染媒染 滴加滴加(Lugol)(Lugol)碘液，染碘液，染1-2min1-2min，水，水 洗。洗。 脱色脱色 滴加滴加95%95%乙醇，脱色乙醇，脱色20-25s20

8、-25s立即水立即水 洗，以终止脱色。洗，以终止脱色。 复染复染 滴加蕃红，染色滴加蕃红，染色2-3min2-3min，水洗。，水洗。 最后用吸水纸轻轻吸干。最后用吸水纸轻轻吸干。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌(G )；被染成红色者是；被染成红色者是革兰革兰 氏阴性菌氏阴性菌(G-)。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 作业作

9、业 实验报告实验报告 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 1、涂片、涂片 1.取一块干净的载玻片平放在载玻片架上，在载取一块干净的载玻片平放在载玻片架上，在载 玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）；玻片中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）； 2.无菌操作无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许 菌苔；菌苔； 3.将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀 并涂成薄膜。并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。宜过多；涂片要涂抹均

10、匀，不宜过厚。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 2、干燥、干燥 v 将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上，将涂好菌膜的载玻片平放在载玻片架上， 室温下自然干燥。室温下自然干燥。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 3、固定、固定 v手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片，手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片， 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2 23 3次，热次，热 固定细菌细胞。固定细菌细胞。 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、使细原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固、使细 菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态，菌细胞质凝固，从而固定细菌细胞形态， 并使之牢

11、固附着在载玻片上。并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚 至破坏细胞形态。至破坏细胞形态。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 4、染色、染色 v将将热固定的细菌热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，涂片平放于在载玻片架上， 滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄 膜为宜）。膜为宜）。 v染色时间：染色时间： 吕氏碱性美蓝染色吕氏碱性美蓝染色12min； 石炭酸复红染色约石炭酸复红染色约1min 草酸铵结晶紫染色约草酸铵结晶紫染色约1min。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程

12、 5、水洗、水洗 v将将细菌细菌涂片上染液倒入废液缸中；涂片上染液倒入废液缸中； v手持手持细菌染色细菌染色涂片，置于废液缸上方，用涂片，置于废液缸上方，用 洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无 色为止。色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使 水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，水从载玻片的一端流下。水流不宜过急， 过大，以免涂片薄膜脱落。过大，以免涂片薄膜脱落。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 6、干燥、干燥 v自然干燥：将染好色的细菌涂片平放在载自然干燥：将染好色的细菌涂片平放在载 玻片架上，

13、室温下自然干燥；玻片架上，室温下自然干燥； v吹干：将染好色的细菌涂片平放在载玻片吹干：将染好色的细菌涂片平放在载玻片 架上，用电吹风冷风或低温热风吹干；架上，用电吹风冷风或低温热风吹干； v吸干：将染好色的细菌涂片平放在一张吸吸干：将染好色的细菌涂片平放在一张吸 水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂 片两面水分吸干。片两面水分吸干。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 7、镜检、镜检 涂片干后镜检。涂片干后镜检。 注意：涂片必须完全干燥后才能用油镜观注意：涂片必须完全干燥后才能用油镜观 察。察。 防止水的折射，以便于观察。防止水的折射，以便于观察

14、。 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 Microbiological Sterile Techniques 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 球菌球菌 肺炎链球菌肺炎链球菌 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 杆菌杆菌 破伤风杆菌破伤风杆菌 肉毒芽孢杆菌肉毒芽孢杆菌 炭疽杆菌炭疽杆菌 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 杆菌杆菌 变形杆菌变形杆菌 大肠杆菌大肠杆菌 绿脓杆菌绿脓杆菌 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 螺菌螺菌 钩端螺旋体钩端螺旋体 幽门螺杆菌幽门螺杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 涂片涂片

15、 干燥干燥 固定固定 染色染色水洗水洗 镜检镜检 简单染色方法简单染色方法 干燥干燥 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革兰氏染色革兰氏染色 菌种菌种: : 参考菌：参考菌：G+：Staphylococcus aureus, G-: Escherichia coli 仪器仪器 显微镜；显微镜； 材料材料 载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸， 吸水纸，染色缸等。吸水纸，染色缸等。 染料染料 草酸铵结晶紫染色液，路哥氏草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)(Lugol) 碘液，碘液，95%95%乙醇，乙醇，0.5%0.5%番红染色液；番红染色液； 基础生物学实验基础生物学实验精品课程精品课程 革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较 成分成分 占细胞壁干重的占细胞壁干重的% 革蓝氏阳性菌革蓝氏阳性菌 革蓝氏阴性菌革蓝氏阴性菌 肽聚糖肽聚糖 含量很高（含量很高（50-9050-90） 含量很低（含量很低（1010） 磷壁酸磷壁酸 含量较高（含量较高（5050） 无无 类脂质类脂质 一般无（一般无（ 2 2） 含量较高（含量较高（2020） 蛋白质蛋白质 无无 含量较高含量较高 基础生物学实验基础生物学实验